Page 80 - 《中国药房》2025年3期

2.5 大鼠创面组织胶原蛋白沉积情况观察 3 结果
采用Masson染色法观察。取“2.4”项下剩余的创面 3.1 OST对大鼠创面愈合率的影响
组织切片，根据 Masson 染色试剂盒说明书方法进行染 与Model组比较，OST-M组、OST-H组大鼠给药第7
色，于光学显微镜下观察创面组织形态并拍照。采用 天和第 14 天的创面愈合率均显著升高（P＜0.05）；与
Image J软件计算胶原蛋白相对表达量，胶原蛋白相对表 OST-L组比较，OST-M组、OST-H组大鼠给药第7天和第
达量＝（蓝染的胶原纤维面积/视野总面积）×100%。 14 天的创面愈合率均显著升高（P＜0.05），且具有剂量
2.6 大鼠创面组织中Ang-1、bFGF水平检测 依赖性（P＜0.05）；与 OST-H 组比较，OST-H+环巴胺组
采用ELISA法检测。将每组剩余6只大鼠处死，剖 大鼠给药第 7 天和第 14 天的创面愈合率均显著降低
取创面组织，一部分置于冰上加入裂解液进行裂解，另 （P＜0.05）。结果见图1和图2。
一部分冻存于－80 ℃条件下，待用。将制备的创面组织
匀浆，根据 ELISA 试剂盒说明书方法操作，检测大鼠创 Model组
面组织中Ang-1、bFGF水平。
2.7 大鼠创面组织中 VEGFA、VEGFR-2 mRNA 相对
表达量检测 OST-L组
采用 RT-qPCR 法检测。取“2.6”项下冻存的创面组
织适量，用Trizol试剂提取总RNA，并反转录为cDNA进
行扩增。扩增体系为：4 μL cDNA，25 μL SYBR Green
PCR Master Mix，正反向引物对各 1 μL，ddH2O 19 μL， OST-M组
总体积为 50 μL。扩增条件为：聚合酶活化 10 min，
94 ℃变性 15 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，45 次循
环。本研究所用引物由生工生物工程（上海）股份有限 OST-H组
公司设计合成，序列信息如表1所示。以β-actin为内参，
采用 2 －ΔΔCt 法计算 VEGFA、VEGFR-2 mRNA 的相对表
达量。 OST-H+环巴胺组
表1 引物序列及产物大小
引物名称 序列（5′→3′） 产物大小/bp 第1天 第7天 第14天
VEGFA 正向：GAGGTCAAGGCTTTTGAAGGC 205 图1 各组大鼠创面愈合情况
反向：CTGTCCTGGTATTGAGGGTGG
100 abc
VEGFR-2 正向：GGCCCAATAATCAGAGTGGCA 189 Model组
反向：CCAGTGTCATTTCCGATCACTTT 80 abc ab OST-L组
β-actin 正向：GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA 112 60 OST-M组
反向：GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG 创面愈合率/% ab d OST-H组
2.8 大鼠创面组织中 VEGFA、VEGFR-2、SHH、GLI1 40 d OST-H+环巴胺组
20
蛋白表达检测
0
采用Western blot法检测。取“2.6”项下冻存的创面 1 7 14
时间/d
组织适量，用RIPA裂解液提取总蛋白，采用BCA法测定
a：与Model组比较，P＜0.05；b：与OST-L组比较，P＜0.05；c：与OST-
蛋白浓度后，进行变性处理。取变性后的蛋白进行十二 M组比较，P＜0.05；d：与OST-H组比较，P＜0.05。
烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，以 5% 牛血清 图2 各组大鼠不同时间点的创面愈合率比较（x±s，
蛋白溶液封闭2 h，加入VEGFA、VEGFR-2、SHH、GLI1、 n＝12）
GAPDH一抗（稀释比例均为1∶1 000）于4 ℃过夜孵育； 3.2 OST对大鼠创面组织病理学变化的影响
加入相应二抗（稀释比例为 1∶5 000）于室温孵育 2 h，采 对照组大鼠皮肤组织表皮完整。Model组大鼠创面
用ECL试剂显色，经凝胶成像后，采用Image J软件进行 组织再上皮化不明显，新生血管数较少，肉芽组织出现
分析，以GAPDH为内参进行归一化。 水肿，炎症细胞浸润严重。与 Model 组相比，OST-L 组、
2.9 统计学方法 OST-M 组、OST-H 组大鼠创面组织再上皮化明显，炎症
采用 GraphPad Prism 7.0 软件对数据进行统计分 细胞浸润和肉芽组织水肿减轻，新生血管数增多，其中
析。实验数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差 OST-H 组大鼠的创面组织损伤明显减轻。与 OST-H 组
分 析 ，进 一 步 两 两 比 较 行 LSD-t 检 验 。 检 验 水 准 相比，OST-H+环巴胺组大鼠创面组织再上皮化不明显，
α＝0.05。 炎症细胞浸润加重，新生血管数减少。结果见图3。

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