Page 81 - 《中国药房》2025年2期
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          NEF和50 μmol/L的Compound C 共同处理24 h。                 1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶5 000、
          2.4 细胞增殖检测                                         1∶2 000），于4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀
              采用 MTT 法检测。取对数生长期 SH-SY5Y 细胞，                  释比例为 1∶10 000），于室温下孵育 2 h；洗膜后，以 ECL
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          按1×10 个/孔接种至96孔板内，按“2.1”“2.3”项下方法                  发光显影、成像。使用 Quantity One 软件分析蛋白条带
          造模、分组、处理。24 h后，按“2.2”项下方法检测各组细                     的灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）的灰度值
          胞的存活率。                                             比值表示目的蛋白的表达水平，再以 LC3-Ⅱ与 LC3-
          2.5 细胞超微形态观察                                       Ⅰ 、p-mTOR 与 mTOR、p-AMPK 与 AMPK、p-ULK1 与
              采用透射电镜观察。取对数生长期 SH-SY5Y 细                      ULK1 的表达水平比值分别表示自噬活性和 mTOR、
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          胞，按 1×10 个/孔接种至 96 孔板内，按“2.1”“2.3”项下               AMPK、ULK1蛋白的磷酸化水平。
          方法造模、分组、处理。24 h后，以1 500 r/min离心5 min，              2.10 统计学方法
          收集细胞，以3%戊二醛溶液固定，再经醋酸双氧铀和枸                              采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。实验数
          橼酸铅染色后，使用透射电镜观察各组细胞的超微形态。                          据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一
          2.6 细胞自噬体数量检测                                      步两两比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
              采用 MDC 染色法检测。取对数生长期 SH-SY5Y                    3 结果
                      5
          细胞，按5×10 个/孔接种至6孔板内，按“2.1”“2.3”项下                  3.1 NEF干预浓度筛选结果
                                                                                            +
          方法造模、分组、处理。24 h 后，收集细胞，用磷酸盐缓                           与对照组（100%）比较，经 MPP 诱导而未经 NEF 处
                                                             理 的 细 胞 的 存 活 率 [（53.64±5.21）% ] 显 著 降 低（P＜
          冲液清洗，每孔加入5×10  mol/L的MDC试剂，于室温
                                －5
                                                                          +
                                                             0.05）。经 MPP 诱导并经 1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L
          下避光孵育15 min，使用荧光显微镜观察各组细胞内自
                                                             的 NEF 处理后，细胞的存活率分别为（56.47±6.25）%、
          噬体（呈绿色荧光）数量的变化情况。
                                                            （67.19±7.03）% 、（79.24±8.18）% 、（88.37±9.09）% 、
          2.7 细胞凋亡检测
                                                            （89.76±9.20）%；当NEF≥2.5 μmol/L时，对应组别细胞
              采用流式细胞术检测。取对数生长期 SH-SY5Y 细
                                                             的存活率均显著高于未经 NEF 处理的细胞（P＜0.05），
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          胞，按5×10 个/孔接种至6孔板内，按“2.1”“2.3”项下方
                                                             且经10.0、20.0 μmol/L NEF处理的细胞的存活率组间比
          法造模、分组、处理。24 h 后，收集细胞，用磷酸盐缓冲
                                                             较差异无统计学意义（P＞0.05）。基于此，本研究选择
          液清洗3次，离心，弃上清液，细胞用培养基调整密度后，
                                                             2.5、5.0、10.0 μmol/L作为后续实验NEF的干预浓度。
          依次加入Annexin Ⅴ-FITC缓冲液、PI染液，于室温下避
                                                             3.2 细胞增殖变化
          光孵育30 min，使用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情
                                                                 与 对 照 组（100%）比 较 ，PD 组 细 胞 的 存 活 率
          况，并记录凋亡率（即流式图右上和右下象限细胞百分
                                                             [ （52.79±5.18）%]显著降低（P＜0.05）；与 PD 组比较，
          率之和）。
                                                             NEF-L、NEF-M、NEF-H 组 细 胞 的 存 活 率 [（68.23±
          2.8 细胞线粒体膜电位检测
                                                             7.09）%、（80.48±8.21）%、（89.78±9.14）%]均显著升高，
              采用JC-1探针法检测。取对数生长期SH-SY5Y细
                                                             且呈浓度依赖性（P＜0.05）；与 NEF-H 组比较，NEF-H+
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          胞，按5×10 个/孔接种至6孔板内，按照“2.1”“2.3”项下
                                                             Compound C 组细胞的存活率[（72.62±7.35）%]显著降
          方法造模、分组、处理。24 h 后，收集细胞，用磷酸盐缓
                                                             低（P＜0.05）。
          冲液清洗，于37 ℃下加入0.5 μmol/L的JC-1探针试剂，                  3.3 细胞超微形态变化
          避光染色1 h；收集细胞，用乙二胺四乙酸-胰蛋白酶分散                            对照组细胞较为完整，形态正常，自噬体较少；与对
          后，使用荧光显微镜观察细胞线粒体膜电位的变化情况                           照组比较，PD组细胞内可见自噬体形成，线粒体中空明
         （JC-1 为单体时，呈绿色荧光，提示线粒体发生损伤，膜                        显；与PD组比较，NEF-L、NEF-M、NEF-H组细胞内部分
          电位较低；JC-1为聚合物时，呈红色荧光，提示线粒体损                        线粒体中空并呈多膜样结构，自噬体明显增多，且上述
          伤缓解，膜电位较高）。                                        变化有一定的浓度依赖趋势；与NEF-H组比较，NEF-H+
          2.9 细胞中凋亡、自噬相关蛋白表达检测                               Compound C 组细胞内线粒体中空减少，自噬体明显亦
              采用Western blot法检测。取对数生长期SH-SY5Y                减少。结果见图1。
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          细胞，按1×10 个/孔接种至6孔板内，按照“2.1”“2.3”项                  3.4 细胞内自噬体数量变化
          下方法造模、分组、处理。24 h后，收集细胞，提取蛋白，                           对照组细胞内绿色荧光较弱，自噬体较少；与对照
          检测浓度后加热变性。取变性蛋白适量，经电泳分离后                           组比较，PD组细胞内绿色荧光增强，自噬体增多；与PD
          转移至聚偏二氟乙烯膜上，于室温下以脱脂牛奶封闭；                           组比较，NEF-L、NEF-M、NEF-H组细胞内绿色荧光进一
          洗 膜 后 ，加 入 Caspase-3、p-mTOR、mTOR、p62、LC3、          步增强，自噬体进一步增多，且上述变化有一定的浓度
          Beclin-1、p-AMPK、AMPK、p-ULK1、ULK1、β-actin 一抗        依赖趋势；与 NEF-H 组比较，NEF-H+Compound C 组细
         （稀释比例分别为 1∶5 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶10 000、          胞内绿色荧光减弱，自噬体减少。结果见图2。


          中国药房  2025年第36卷第2期                                                 China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 2    · 199 ·
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