Page 80 - 《中国药房》2025年2期

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是全球第二常见 品（批号 HY-13418A，纯度 99.91%）、1-甲基-4-苯基吡啶
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的神经退行性疾病，全球患病人数超过 600 万 。由于 离子（1-methyl-4-phenylpyridinium ion，MPP ；批号 HY-
老年人口不断增长，PD发病率逐渐升高，其预防及治疗 W008719，纯度 99.94%）均购自美国 MCE 公司；兔源胱
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以药物为主，但副作用较多、疗效有限 。PD 病理机制 天蛋白酶 3（Caspase-3）、磷酸化 AMPK（phosphorylated
复杂且高度多样，以静止性震颤、肌肉僵硬、运动迟缓等 AMPK，p-AMPK）、磷 酸 化 mTOR（phosphorylated
多种运动症状为主要临床表现；此外，非运动症状在PD mTOR，p-mTOR）、磷酸化 ULK1（phosphorylated ULK1，
患者中也较为常见，包括认知和行为障碍、睡眠不规律、 p-ULK1）、AMPK、mTOR、ULK1、Beclin-1、β-肌动蛋白
感觉和自主神经功能障碍 [2―3] 。 （β-actin）抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋
甲基莲心碱（neferine，NEF）是从莲种子中提取的双 白G二抗、DMEM培养基（批号分别为MA5-45039、PA5-
苄基异喹啉生物碱成分，具有抗炎、抗氧化、抗心律失 104982、44-1125G、PA5-78249、PA5-105297、PA5-34663、
常、抗高血压、抗血栓形成、抗血小板聚集、改善遗忘等 MA5-32699、PA1-16857、PA1-183、31460、11965092）均
多种药理活性，已被用于高热、心律失常、高血压、血小 购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司；兔源 p62、微管
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板聚集、肥胖和睡眠不足等症的治疗 。据报道，NEF可 相关蛋白 1 轻链 3（microtubule-associated protein 1 light
通过阻断核因子κB信号转导来抑制脂多糖介导的小胶 chain 3，LC3）抗体（批号分别为 ab109012、ab192890）均
购自英国 Abcam 公司；Annexin Ⅴ-FITC 细胞凋亡检测
质细胞活化，进而抑制慢性神经炎症，对PD小鼠具有一
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定的保护作用 ，但具体作用机制尚不完全清楚。 试剂盒（批号WK304）购自北京百奥莱博科技有限公司；
单丹磺酰尸胺（monodansyl cadaverine，MDC）试剂盒、线
研究指出，自噬是负责细胞清除和维持细胞稳态的
粒体膜电位试剂盒（批号分别为C3018S、C2006）均购自
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生物学过程，可能是PD发病机制的重要组成部分 。腺
上海碧云天生物技术有限公司。
苷一磷酸活化的蛋白激酶（adenosine monophosphate
1.3 细胞
activated protein kinase，AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋
人神经母细胞瘤细胞 SH-SY5Y（批号 SNL-092）购
白（mammalian target of rapamycin，mTOR）/UNC-51 样
自武汉尚恩生物技术有限公司。
激酶1（UNC-51-like kinase 1，ULK1）信号通路与自噬调
2 方法
节相关。其中，AMPK为高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白
2.1 SH-SY5Y细胞培养与PD细胞模型建立
激酶，是调节代谢过程和炎症反应的关键能量传感器，
取 SH-SY5Y 细胞，在常规条件下培养，待其生长、
可 直 接 磷 酸 化 mTOR 复 合 物 1（mTOR complex 1，
融合至80%～90%时进行实验。取上述SH-SY5Y细胞，
mTORC1）信号通路的若干组分，从而导致 mTORC1 活
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用100 μmol/L的MPP 诱导培养24 h，以构建PD细胞模
性下调，减少 mTOR 的表达，下调的 mTOR 则可通过磷
型（经MTT法检测，若诱导后的细胞存活率较正常细胞
酸化促使 ULK1 活化并促进自噬的发生 。据报道，厚
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显著降低，则说明PD细胞模型构建成功） 。
朴酚可通过激活 AMPK/mTOR/ULK1 信号通路促进自
2.2 NEF干预浓度筛选
噬，从而改善阿尔茨海默病相关病理损伤 。但 NEF 是
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依据相关文献 及前期实验结果，将构建成功的PD
否能够通过调节 AMPK/mTOR/ULK1 信号通路来影响
模型细胞用不同浓度的 NEF（0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0
PD 细胞的线粒体自噬尚不清楚。为此，本研究基于
μmol/L）处理 24 h，另设不加 MPP 、NEF 的对照组以及
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AMPK/mTOR/ULK1 信号通路，初步探讨 NEF 对 PD 细
不加药物、不加细胞的空白组，每组设置6个复孔。处理
胞线粒体自噬的影响，旨在为阐明 NEF 改善 PD 的作用
后，每孔细胞加入 MTT 溶液 10 μL，孵育 4 h，加二甲基
机制提供参考。
亚砜混匀，用酶标仪于490 nm波长下检测其吸光度，并
1 材料 按下式计算细胞存活率：细胞存活率＝（实验组吸光
1.1 主要仪器 度－空白组吸光度）/（对照组吸光度－空白组吸光度）×
本研究所用主要仪器包括 GENios Plus 型酶标仪 100%。根据细胞存活率检测结果筛选最优药物干预浓
TM
（成都市科迈普生物科技有限公司）、Forma Steri- 度，用于后续实验。
TM
Cycle i160 型 CO2培养箱和 Talos L120C TEM 型透射 2.3 细胞分组与给药
电镜（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）、BX51 型荧光 将 PD 模型细胞随机分为 PD 组和 NEF 低、中、高
TM
显微镜（日本 Olympus 公司）、FACSymphony A5 型流 浓度处理组（NEF-L、NEF-M、NEF-H 组）以及 NEF 高
式细胞仪（美国 BD 公司）、Tanon EPS 600 型电泳仪（上 浓度+AMPK 抑制剂组（NEF-H+Compound C 组），另取
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海天能科技有限公司）等。 未经MPP 、NEF处理的SH-SY5Y细胞作为对照组，每组
1.2 主要药品与试剂 设6个复孔。NEF-L、NEF-M、NEF-H组细胞分别用2.5、
NEF对照品（批号SN8050，纯度≥98%）购自北京索 5.0、10.0 μmol/L 的 NEF（浓度根据“2.2”项下结果设置）
莱宝科技有限公司；AMPK 抑制剂 Compound C 的对照 处理24 h，NEF-H+Compound C组细胞用10.0 μmol/L的
· 198 · China Pharmacy 2025 Vol. 36 No. 2 中国药房 2025年第36卷第2期