Page 75 - 《中国药房》2025年2期

2.3 MKN-7细胞克隆形成能力检测 细胞，按“2.2”项下方法分组、处理。培养24 h后，收集各
采用克隆形成实验检测。取对数生长期的 MKN-7 组细胞，提取蛋白。蛋白经定量、变性后进行电泳分离、
细胞，按“2.2”项下方法分组、处理。培养 10 d（每 3 d 更 转膜、封闭；洗膜后，加入ThPOK、PD-1、PD-L1、GAPDH
换培养基并重新给药）后，弃去培养基，细胞以 4% 多聚 一抗（稀释比例分别为1∶500、1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000），
甲醛溶液固定 30 min，再以 0.1% 结晶紫染液染色 30 于4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀释比例均
min；移除染液，细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗，风干 为 1∶5 000），于室温下孵育 1 h，使用化学发光试剂显影
后，使用显微镜观察并记录各组的细胞克隆数（＞10 个 后，于化学发光成像仪下成像。使用 Image J 软件，以
细胞即算1个克隆）。 GAPDH为内参，量化各目的蛋白的表达情况。
2.4 MKN-7细胞迁移和侵袭能力检测 2.9 统计学方法
均 采 用 Transwell 实 验 检 测 。 取 对 数 生 长 期 的
采用 SPSS 26.00 软件对数据进行统计分析。数据
MKN-7 细胞，经消化后以 PBS 漂洗，并以不含血清的
以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步
5
RPMI-1640培养基重悬，制成1×10 个/mL的细胞悬液。
两两比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
取上述悬液100 μL，加至Transwell小室上层；取完全培
3 结果
养基 600 μL，置于小室下层。上层细胞按“2.2”项下方
3.1 IMP-SD干预浓度的筛选结果
法分组、处理。培养 24 h 后，收集穿膜细胞，以 4% 多聚
经0、20、40、80、160、200 μmol/L IMP-SD干预后，细
甲醛溶液固定 30 min，再以 0.1％结晶紫染液染色 10
胞存活率随其浓度的增加而逐渐降低，IC50 为 168.42
min，自然风干后，使用显微镜观察并记录各组的迁移细
μmol/L，遂确定以 40、80、160 μmol/L 作为后续实验的
胞数。以基质胶处理小室上层，其余操作同前，使用显
低、中、高浓度。结果见图1。
微镜观察并记录各组的侵袭细胞数。
100
2.5 MKN-7细胞凋亡检测
采用流式细胞术检测。取对数生长期的MKN-7细 75
胞，按“2.2”项下方法分组、处理。培养24 h后，收集各组 细胞存活率/%
细胞，以PBS漂洗后，加入binding buffer 200 μL重悬；加 50
入Annexin Ⅴ-FITC染液5 μL，于室温下孵育10 min；加
入PI染液10 μL，于避光条件下孵育10 min，使用流式细 25
0 20 40 80 160 200
胞仪检测各组细胞凋亡情况。 IMP-SD浓度/（μmol/L）
2.6 NK细胞对MKN-7细胞的杀伤作用检测 图1 不同浓度 IMP-SD 对细胞存活率的影响（x±s，
采用乳酸脱氢酶释放法检测。取对数生长期的 n＝6）
MKN-7 细胞，按“2.2”项下方法分组、处理。培养 24 h 3.2 IMP-SD对MKN-7细胞克隆形成能力的影响
后，收集各组细胞，与 NK 细胞（各组 MKN-7 细胞与 NK
与对照组比较，L-IMP-SD、M-IMP-SD、H-IMP-SD
细胞的数量比均为1∶10）混合，于37 ℃下共同培养6 h；
组的细胞克隆数均显著降低，且有浓度依赖性（P＜
收集细胞，加入乳酸脱氢酶 50 μL，于室温下孵育 30
0.05）；与 H-IMP-SD 组、si-NC 组比较，si-ThPOK 组的细
min，使用酶标仪于450 nm波长处检测其光密度（OD450 ）
胞克隆数显著升高（P＜0.05）。结果见图2、图3。
值，再按相应试剂盒说明书方法计算NK细胞杀伤活性。
200
2.7 MKN-7细胞的T细胞分布情况检测
采用流式细胞术检测。取对数生长期的MKN-7细 150
a de
胞，按“2.2”项下方法分组、处理。培养24 h后，收集各组
+
+
细胞，分别与 CD4 T、CD8 T 细胞（各组 MKN-7 细胞与 细胞克隆数 100 ab
T细胞的数量比均为1∶10）混合，于37 ℃下共同培养6 h； abc
50
+
+
收集细胞，分别加入 CD4 、CD8 荧光抗体（稀释比例均
为 1∶500），于室温下避光孵育20 min；收集细胞，以PBS
0
重悬后，使用流式细胞仪分析CD4 T细胞、CD8 T细胞 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ
+
+
+
+
比例及两者比值（CD4 T/CD8 T）。 Ⅰ：对照组；Ⅱ：L-IMP-SD 组；Ⅲ：M-IMP-SD 组；Ⅳ：H-IMP-SD
组；Ⅴ：si-NC 组；Ⅵ：si-ThPOK 组；a：与对照组比较，P＜0.05；b：与L-
2.8 MKN-7 细胞中 ThPOK、PD-1、PD-L1 蛋白表达
IMP-SD组比较，P＜0.05；c：与M-IMP-SD组比较，P＜0.05；d：与H-
检测 IMP-SD组比较，P＜0.05；e：与si-NC组比较，P＜0.05。
采用Western blot法检测。取对数生长期的MKN-7 图2 各组细胞克隆数比较（x±s，n＝6）
中国药房 2025年第36卷第2期 China Pharmacy 2025 Vol. 36 No. 2 · 193 ·