Page 30 - 《中国药房》2024年21期

多，说明这2条信号通路可能在GA降低DOX诱导的心 条带到达玻璃板底部时结束电泳。将聚偏二氟乙烯
脏毒性中发挥重要作用，故后续本课题组针对这2条信 （PVDF）膜于甲醇中活化 1 min，设定电流为 250 mA，于
号通路中的重要靶点（Apelin、PI3K和Akt）进行验证。 冰浴中转膜 60 min。结束后，将 PVDF 膜放入适量 5%
2.5 小鼠心脏组织中 Apelin、PI3K 和 Akt mRNA 表达 脱脂奶粉中，于脱色摇床上振荡封闭 1 h。分别加入
的检测 GAPDH（稀释度为1∶10 000）、Apelin（稀释度为1∶2 000）
采用 qRT-PCR 法检测。取“2.1”项下每组 3 只小鼠 和 PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt（稀释度均为 1∶1 000）一抗，
心脏组织，分别按 RNA 提取试剂盒的说明书提取组 4 ℃孵育过夜。用TBST清洗5次，加入相应二抗（稀释度
织中总 RNA，经检验合格后，按逆转录试剂盒方法将 均为1∶3 000），孵育 1 h 后，用 TBST 再次清洗 5 次。在
RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增， PVDF膜上加高强度化学发光混合溶液对条带进行曝光
引物序列设计由四维加生物科技（武汉）有限公司完成， 显影，保存扫描的胶片。用 Image J 软件分析目标条带
®
详见表 1。扩增体系如下（共 10 μL）：×SYBR Green 的灰度值，通过目的蛋白与 GAPDH（内参）蛋白条带灰
Pro Taq HS Premix 5 μL，上、下游引物各 1 μL，DNA 度值的比值计算各目的蛋白的表达水平，以磷酸化蛋白
template 2 μL，H2O 1 μL。PCR 扩增条件如下：95 ℃预 与未磷酸化蛋白的表达水平比值表示该蛋白的磷酸化
变性 30 s；95 ℃变性 5 s，60 ℃退火 30 s，65～95 ℃延伸 水平。按“2.5”项下方法进行统计学分析。结果见图
5 s，循环 40 次。以 GAPDH 作为内参，采用 2 －∆∆Ct 法计算 3、表3。
Apelin、PI3K 和 Akt mRNA 的相对表达量。应用 Graph‐
Apelin 9 kDa
Pad Prism 8 软件对数据进行分析。本实验数据均符合
正态分布，以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分
p-PI3K 85 kDa
析，进一步两两比较采用LSD-t检验，检验水准α＝0.05。
结果显示，与 CON 组比较，DOX 组小鼠心脏组织中
PI3K 85 kDa
Apelin、PI3K 和 Akt 的 mRNA 相对表达量均显著降低
（P＜0.01）；与 DOX 组比较，GDOX 组小鼠心脏组织中 p-Akt 60 kDa
Apelin、PI3K 和 Akt 的 mRNA 相对表达量均显著升高
（P＜0.01）。结果见表2。 Akt 62 kDa
表1 引物序列及产物长度
基因名称 引物序列（5′→3′） 产物长度/bp GAPDH 36 kDa
GAPDH 正向引物：TGTTTCCTCGTCCCGTAGA 106
CON组 DOX组 GDOX组
反向引物：ATCTCCACTTTGCCACTGC 图3 各组小鼠心脏组织中Apelin、p-PI3K、PI3K、p-Akt
Apelin 正向引物：CTGGGTTTAGTGAAGCGGGT 118
反向引物：TTAGGGACTATTCCGGGCCA 和Akt蛋白表达的电泳图
Akt 正向引物：GCCGCCTGATCAAGTTCTCC 115 表3 各组小鼠心脏组织中Apelin、PI3K蛋白表达水平
反向引物：TTCAGATGATCCATGCGGGG
PI3K 正向引物：CACCTTAAATGGTGAGCACGG 169 和PI3K、Akt蛋白的磷酸化水平比较（x±s，n＝3）
反向引物：ACACCCCAGCCAATCAAGTC 组别 Apelin/GAPDH p-PI3K/PI3K PI3K/GAPDH p-Akt/Akt Akt/GAPDH
表2 各组小鼠心脏组织中Apelin、PI3K和Akt的mRNA CON组 1.02±0.06 0.71±0.18 0.96±0.04 0.99±0.01 0.98±0.09
DOX组 0.65±0.16 a 0.13±0.05 a 0.75±0.10 a 0.36±0.27 a 0.83±0.10
相对表达量比较（x±s，n＝3） GDOX组 0.77±0.11 0.44±0.18 b 0.89±0.02 0.83±0.09 b 0.90±0.06
组别 Apelin mRNA PI3K mRNA Akt mRNA a：与CON组比较，P＜0.05；b：与DOX组比较，P＜0.05。
CON组 1.04±0.06 1.04±0.06 1.10±0.09 结果显示，与CON组比较，DOX组小鼠心脏组织中
DOX组 0.41±0.01 a 0.41±0.04 a 0.56±0.05 a
GDOX组 0.71±0.04 b 0.68±0.04 b 0.87±0.06 b Apelin、PI3K 蛋白表达水平和 PI3K、Akt 蛋白的磷酸化
a：与CON组比较，P＜0.01；b：与DOX组比较，P＜0.01。 水平均显著降低（P＜0.05）；与DOX组比较，GDOX组小
2.6 小鼠心脏组织中 Apelin、p-PI3K、PI3K、p-Akt 和 鼠心脏组织中PI3K、Akt蛋白的磷酸化水平均显著升高
Akt蛋白表达的检测 （P＜0.05）。
采用 Western blot 法检测。取“2.1”项下每组 3 只小 2.7 DOX和GA对H9c2细胞活力的影响
鼠心脏组织，加入蛋白提取剂，冰浴彻底匀浆后，在 将H9c2细胞置于含10%胎牛血清和1%双抗（青霉
4 ℃下以 12 000 r/min 离心 5 min，收集上清液，即为总 素-链霉素）的DMEM培养基中，于37 ℃、5%CO2培养箱
蛋白溶液。用 BCA 试剂盒测定总蛋白浓度后，于 98 ℃ 中培养。取对数生长期的 H9c2 细胞接种至 96 孔板中，
5
条件下加热变性。每组取 10 μL 变性蛋白上样进行电 细胞密度为1×10 个/mL，每孔90 μL。于培养箱中孵育
泳，电泳条件为浓缩胶电压 80 V，分离胶电压 120 V，待 24 h 后，将细胞分为 CON 组（不给药，即对照组）、DOX

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