Page 28 - 《中国药房》2024年21期
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drogenase，GAPDH）单克隆抗体、兔源爱帕琳肽（Apelin）                其打断，以mRNA碎片作为合成cDNA第1链的模板，在
          单克隆抗体、兔源磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphoinositide                 此基础上合成cDNA的第2条链。对双链cDNA进行纯
          3-kinase，PI3K）单 克 隆 抗 体（批 号 分 别 为 ab8245、           化、修复，构建cDNA文库，上机测序。将原始序列（raw
          ab181786、ab191606）均购自英国Abcam公司；兔源蛋白                 reads）去除低质量碱基序列后获得高质量序列（clean
          激酶 B（protein kinase B，Akt）抗体（批号 10176-2-AP）         reads），通过HISAT2软件对clean reads和参考基因组进
          购自武汉三鹰生物技术有限公司；兔源磷酸化 PI3K                           行序列比对，获取其在参考基因组上的位置信息。转录
         （p-PI3K）单克隆抗体、兔源磷酸化Akt（p-Akt）单克隆抗                    组学测序工作由上海中科新生命生物科技有限公司协
          体（批号分别为 4228、4060）均购自美国 Cell Signaling              助完成。
          Technology 公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗                    2.2.2 差异表达基因筛选及功能分析
          兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、HRP标记的山羊抗鼠IgG二                           利用 R 包 DESeq2 对组间基因进行筛选，筛选条件
          抗（批号分别为E-AB-1003、E-AB-1001）均购自武汉伊莱                  为差异倍数（fold change，FC）＞1.2 或 FC＜0.8 且 P＜
          瑞特生物科技股份有限公司；DMEM 培养基、胎牛血清                          0.05。结果显示，与正常小鼠比较，经 DOX 作用后基因
          均购自美国Gibco公司；甲酸、甲醇和乙腈均为质谱纯。
                                                              发生显著改变且经GA治疗后回调的差异表达基因（dif‐
          1.3 动物
                                                              ferentially expressed genes，DEGs）有242个。其中，DOX
              本研究所用动物为 SPF 级雄性 ICR 小鼠，共 36 只，
                                                              组显著上调而GDOX组显著下调的DEGs有72个，DOX
          体重 18～22 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，生
                                                              组显著下调而GDOX组显著上调的DEGs有170个。
          产许可证号为 SCXK（湘）2022-0011。动物均饲养于温
                                                                  采用微生信在线平台（https：//www.bioinformatics.
          度 18～25 ℃、相对湿度 50%～70% 的环境中，饲养期间
                                                              com.cn）绘制DEGs的聚类热图（图1A），展示DEGs在不
          小鼠自由进食、饮水。本实验方案已通过贵州医科大学
                                                              同组间的表达量变化。将得到的 DEGs 导入 DAVID 数
          实验动物伦理委员会批准，批准编号为2101200。
                                                              据库（https：//david.ncifcrf.gov/）进行京都基因与基因组
          1.4 细胞
                                                              百 科 全 书（Kyoto  encyclopedia  of  genes  and  genomes，
              大鼠心肌细胞H9c2购自中国科学院上海生命科学
                                                              KEGG）通路富集分析，共富集得到 31 条代谢通路。按
          研究院细胞资源中心。
                                                              照 P 值大小，选取排前 20 名的条目，并通过 HiPlot 网站
          2 方法与结果
                                                             （https：//hiplot.com.cn/home/index.html）进行可视化分
          2.1 动物分组、造模、给药与样本收集
                                                              析。结果显示，GA减轻DOX诱导的心脏毒性的机制涉
              36 只小鼠经过 7 d 适应性喂养后，按随机数字表法
                                                              及肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy）、Apelin
          分为正常对照组（CON 组）、模型组（DOX 组）和治疗组
                                                              信号通路（Apelin signaling pathway）、PI3K-Akt 信号通路
         （GDOX 组），每 组 12 只 。 除 CON 组 外 ，DOX 组 和
                                                             （PI3K-Akt signaling pathway）等，详见图1B。
          GDOX 组小鼠隔天尾静脉注射 3 mg/kg 的 DOX 药液 1
                                                              2.3 小鼠心脏组织的蛋白质组学研究
          次，并且 GDOX 组小鼠在 DOX 组的基础上每天灌胃
                                                              2.3.1 样品处理及数据采集
          100 mg/kg的GA混悬液1次；CON组小鼠隔天尾静脉注
                                                                  分别从“2.1”项下CON组、DOX组和GDOX组中随
          射+每天灌胃等体积生理盐水。连续给药/生理盐水15 d。
                                                              机选取 3 只小鼠的心脏组织（每只约 50 mg），于冰上剪
          末次给药/生理盐水后，取出小鼠心脏组织，用无RNA酶
          磷酸盐缓冲液清洗干净后，放于－80 ℃下保存，备用。                          碎，加入适量SDT裂解液在冰上匀浆后静置5 min，然后
                                                              在 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 10 min，收集上清液并于
          本课题组前期通过生化试剂盒检测了按上述方法分组、
          给药后小鼠血清中天冬氨酸转氨酶、肌酸激酶、肌酸激                            －80 ℃保存。采用过滤器辅助样品制备法对获得的肽
                                                                        [6]
          酶同工酶和乳酸脱氢酶水平，已证实了 GA 具有减轻                           段进行洗脱 ，经真空冷冻干燥后的肽段用 40 μL 0.1%
                                 [5]
          DOX心脏毒性的药效作用 ，故本实验获取的各组小鼠                           甲酸复溶，上机采集数据。仪器检测条件如下：流动相
          心脏组织可用于组学分析及验证实验。                                   A为0.1%甲酸-水、流动相B为0.1%甲酸-乙腈-水，梯度
          2.2 小鼠心脏组织的转录组学研究                                   洗脱（0～3.00 min，5%B→8%B；3.00～43.00 min，8%B→
          2.2.1 RNA提取、测序及序列比对                                 26%B；43.00～48.00  min，26%B→40%B；48.00～50.00
              分别从“2.1”项下CON组、DOX组和GDOX组中随                     min，40%B→90%B；50.00～60.00 min，90%B）；流速为
          机选取3只小鼠的心脏组织（每只约50 mg），冰上解冻后                        300 nL/min；正离子模式下离子源电压为1.5 kV，扫描范
          加入1 mL 的 Trizol 试剂，匀浆，并于冰上静置 10 min 以               围为质荷比（m/z）100～1 700。蛋白质组学测序工作由
          充分提取总 RNA。用 Oligo（dT）磁珠富集 mRNA 并将                   上海中科新生命生物科技有限公司协助完成。


          · 2598 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 21                            中国药房  2024年第35卷第21期
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