Page 35 - 《中国药房》2024年21期
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并均匀涂抹约 0.5 mL 混合烧伤燃料（配方为普通汽油                       奶粉在 37 ℃条件下封闭 1 h；再于 4 ℃下与一抗 PI3K
          25 mL、95%乙醇60 g、松香60 g、生胶6 g），随后点火，燃              （稀释倍数为 1∶1 000）、p-PI3K（稀释倍数为 1∶1 000）、
          烧15 s后用湿布迅速扑灭火焰。以烧伤创面皮肤发红，                         p-AKT（稀释倍数为1∶500）、AKT（稀释倍数为1∶1 000）、
                                      [12]
          出现水泡及渗液为建模成功标准 。                                   p-mTOR（稀释倍数为 1∶1 000）、mTOR（稀释倍数为
              造模成功后，每组均选取 10 只大鼠进行后续实                        1∶1 000）和GAPDH（稀释倍数为1∶2 000）孵育过夜，随
          验。造模大鼠于烧伤后 2 h内给药，其中模型组涂抹5%                        后继续与HRP标记的山羊抗兔或抗鼠IgG二抗（稀释倍
          羧甲基纤维素钠空白基质，CAS 低、高剂量组分别涂抹                         数均为1∶1 000）于37 ℃条件下孵育2 h。最后采用ECL
          15 mL浓度为30、60 mmol/L的CAS药液（以生理盐水为                  试剂盒显色，通过凝胶成像系统和 Image J 软件分析蛋
                                               [13]
          溶剂，根据前期实验结果并结合相关文献 确定给药                            白条带的灰度值。以目的蛋白与内参（GAPDH）蛋白条
          量），CAS 高剂量+LY294002组涂抹15 mL CAS药液（浓                带灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平，以磷酸化蛋
          度为60 mmol/L）和 LY294002 溶液（以二甲基亚砜为溶                 白与未磷酸化蛋白表达水平的比值表示该蛋白的磷酸
                                        [14]
          剂，浓度为20 μmmol/L）的混合溶液 ，阳性对照组涂抹                     化水平。
          京万红软膏（厚涂药膏 0.5～1.0 cm）。同时选取对照组                     2.7 统计学方法
          大鼠 10 只，涂抹等体积生理盐水。每天涂抹给药 1 次，                          采用GraphPad Prism 9.0软件对数据进行统计分析。
          连续28 d。                                            计量资料首先进行正态分布检验，符合正态分布的数据
          2.2 大鼠烧伤创面愈合率测定                                    以x±s的形式表示。多组间比较采用单因素方差分析，
              测量各组大鼠药物干预前及给药28 d后创面面积，                       组间两两比较采用Tukey’s检验。检验水准α＝0.05。
          并计算烧伤创面愈合率。烧伤创面愈合率＝（药物干预                           3 结果
          前创面面积－给药28 d后创面面积）/药物干预前创面面                        3.1 大鼠烧伤创面愈合率测定结果
          积×100%。                                                与模型组[烧伤创面愈合率（30.39±3.26）%]比较，
          2.3 大鼠血清中炎症因子水平测定                                  CAS低、高剂量组和阳性对照组大鼠烧伤创面愈合率[分
              在首次给药后次日及末次给药后次日，于小鼠腹主                         别为（48.22±5.11）%、（65.06±6.92）%、（62.15±6.55）%]
          动脉取血 2 mL，在 3 000 r/min 条件下离心 10 min，收集            均显著升高（P＜0.05），且 CAS 高剂量组与阳性对照组
          上层血清，保存至－80 ℃下，备用。采用ELISA法按照                       大鼠烧伤创面愈合率差异无统计学意义（P＞0.05）；与
          各检测试剂盒说明书规定步骤，测定各组大鼠血清中                            CAS高剂量组比较，CAS高剂量+LY294002组大鼠烧伤
          TNF-α、IL-1β、IL-6水平。                                创面愈合率[（38.29±4.03）%]显著降低（P＜0.05）。
          2.4 大鼠血清中血管生成相关因子表达水平测定                            3.2 大鼠血清中炎症因子水平测定结果
              取“2.3”项下血清，常规解冻后，按照 ELISA 试剂盒                      与对照组比较，模型组大鼠首次给药后次日及末次
          说明测定大鼠血清中MMP-2、VEGF、MMP-9水平。                       给药后次日血清中 IL-6、IL-1β、TNF-α 水平均显著升高
          2.5 大鼠烧伤创面病理变化观察                                  （P＜0.05）；与模型组比较，CAS 低、高剂量组和阳性对
              各组随机选择 5 只大鼠，断颈处死。对照组大鼠取                       照组大鼠首次给药后次日及末次给药后次日血清中
          正常皮肤组织，其他组大鼠取烧伤创面中央组织，以4%                          IL-6、IL-1β、TNF-α 水平均显著降低，其中 CAS 高剂量
          多聚甲醛溶液固定，备用；另外5只大鼠取同样部位皮肤                          组较 CAS 低剂量组降低更为明显（P＜0.05），且 CAS 高
          组织，冻存于液氮中，备用。                                      剂量组上述指标水平与阳性对照组比较差异无统计学
              取上述用4%多聚甲醛溶液固定24 h的对照组大鼠                       意义（P＞0.05）；与 CAS 高剂量组比较，CAS 高剂量+
          正常皮肤组织以及其他组大鼠烧伤创面中央组织，经脱                           LY294002组大鼠首次给药后次日及末次给药后次日血
          水、石蜡包埋、切片后，进行常规HE染色及封片处理，随                         清 中 上 述 指 标 水 平 均 显 著 升 高（P＜0.05）。 结 果
          后置于显微镜下观察其组织病理学变化。                                 见表1。
          2.6 大鼠烧伤组织中PI3K/AKT/mTOR信号通路相关                     3.3 大鼠血清中血管生成相关因子水平测定结果
          蛋白表达测定                                                 与对照组比较，模型组大鼠血清中VEGF水平显著
              取“2.5”项下冻存的对照组大鼠正常皮肤组织以及                       降低（P＜0.05），MMP-2、MMP-9 水平均显著升高（P＜
          其他组大鼠烧伤创面中央组织，加入 RIPA 裂解液提取                        0.05）；与模型组比较，CAS 低、高剂量组和阳性对照组
          总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，以95 ℃煮10 min使                     大鼠血清中 VEGF 水平均显著升高（P＜0.05），MMP-2、
          蛋白变性。取变性蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰                           MMP-9 水平均显著降低（P＜0.05），其中 CAS 高剂量组
          胺凝胶电泳，然后转至聚偏二氟乙烯膜上，采用5%脱脂                          上述指标变化较 CAS 低剂量组更明显（P＜0.05），且


          中国药房  2024年第35卷第21期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 21    · 2605 ·
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