Page 25 - 《中国药房》2024年20期
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哮喘是一种慢性炎症性气道疾病，是儿科人群最常                         为SCXK（鲁）2023 0010。所有大鼠均在室温22～24 ℃、
          见的慢性疾病，主要临床症状包括干咳、呼吸急促、喘                           相对湿度55%～65%、每12 h昼夜循环的环境中饲养，自
          息、胸闷等 。目前，吸入性皮质类固醇是临床治疗哮喘                          由饮水、摄食。本实验得到烟台蓝纳成生物技术有限公司
                   [1]
          使用最广泛的药物，但长期使用会损害患者肾脏、肝脏、                          实验动物伦理委员会批准，批件编号为2023-07-103。
                                                       [2]
          心脏和消化、免疫系统，并导致各种恶性肿瘤的发生 。                          2 方法
          因此，亟须寻找更高效、更安全的新型替代治疗药物。                           2.1 哮喘幼年大鼠模型构建
              金合欢素是一种从菊花、金合欢和雪莲等多种药用                             分别在造模的第 1、8、15 天腹腔注射卵清蛋白混悬
          植物中提取的类黄酮化合物，分子量小、毒性低，具有抗                          液（卵清蛋白20 μg+氢氧化铝凝胶2 mg）0.2 mL致敏，造
          炎等药理活性。研究指出，金合欢素可改善模型小鼠的                           模的第 16～22 天雾化吸入含 4% 卵清蛋白的生理盐水
                  [3]
          哮喘症状 ，但具体机制尚不完全明确。相关研究显示，                         （每天1次）增敏 。当大鼠出现打喷嚏、呼吸加快、精神
                                                                           [6]
          沉 默 信 息 调 节 因 子 1（silence  information  regulator  1，  萎靡不振等症状，且支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar
          SIRT1）/AMP 活 化 蛋 白 激 酶（AMP-activated  protein        lavage fluid，BALF）中细胞总数、嗜酸性粒细胞数占比均
          kinase，AMPK）信号通路的激活可抑制过氧化氢诱导的                      较正常大鼠明显升高，肺组织中有大量炎症细胞浸润和
          小鼠气道平滑肌细胞增殖，有助于改善哮喘小鼠的气道                           杯状细胞异常增生时，表明哮喘模型构建成功。
              [4]
          重塑 。此外，相关研究发现，金合欢素可通过激活                            2.2 分组与给药
          SIRT1/AMPK 信号通路来抑制血管紧张素Ⅱ引起的心                           将大鼠随机分为对照组、哮喘组、金合欢素组、EX-
                [5]
          肌肥大 。基于此，本研究拟通过构建哮喘幼年大鼠模                           527组、金合欢素+EX-527组，每组12只（雌雄各半）。除
          型，初步探究金合欢素对其干预作用及潜在机制，以期                           对照组外，其余各组大鼠按“2.1”项下方法复制哮喘幼年
          为哮喘的药物研发及临床治疗提供参考。                                 大鼠模型。对照组大鼠以生理盐水代替致敏药物，其余
          1 材料                                               操作同“2.1”项。
          1.1 主要仪器                                               造模成功后，金合欢素组大鼠灌胃13.33 mg/kg金合
              本研究所用主要仪器包括TC20型全自动细胞计数                        欢素（溶于少量乙醇后，再用生理盐水稀释） ，同时腹腔
                                                                                                  [3]
          仪（美国 Bio-Rad 公司）、Multiskan GO 型酶标仪（美国              注射与 EX-527 腹腔注射体积相同的生理盐水；EX-527
                                                                                          [7]
          Thermo Fisher Scientific 公司）、BX61 型光学显微镜（日         组大鼠腹腔注射 1 mg/kg EX-527 ，同时灌胃与金合欢
          本 Olympus 公司）、UV1700 型分光光度计（上海奥析科                  素灌胃体积相同的生理盐水；金合欢素+EX-527组大鼠
          学仪器有限公司）等。                                         灌胃 13.33 mg/kg 金合欢素+腹腔注射 1 mg/kg EX-527；
          1.2 主要药品与试剂                                        对照组、哮喘组大鼠均灌胃与金合欢素灌胃体积相同的
              金合欢素对照品（纯度≥98%，货号SS0721）购自范                    生理盐水+腹腔注射与 EX-527 腹腔注射体积相同的生
          德（北京）生物科技有限责任公司；SIRT1抑制剂EX-527                     理盐水。每天1次，持续2周。
          的原料药（纯度 99.89%）、卵清蛋白（货号分别为 HY-                     2.3 大鼠BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞数占比检测
          15452、HY-W250978）均购自美国MCE公司；大鼠白细胞                      末次给药后，取各组大鼠，依次向其气管中缓慢注
          介素 5（interleukin-5，IL-5）、IL-4、肿瘤坏死因子 α（tumor       入 2、2、1 mL 生理盐水；收集相应 BALF，混匀，取适量，
          necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附测定（ELISA）试           于室温下以 1 500 r/min 离心 10 min，取上清液，加入磷
          剂盒（货号分别为 YM-S1630、YM-S1727、YM-S1716）               酸盐缓冲液（PBS）2 mL，混匀，利用全自动细胞计数仪
          均购自上海远慕生物科技有限公司；过碘酸希夫染色                            检测其中细胞总数、嗜酸性粒细胞数占比。
         （periodic acid-Schiff staining，PAS）试剂盒（货号C0142S）    2.4 大鼠BALF中IL-5、IL-4、TNF-α水平检测
          购自上海碧云天生物技术股份有限公司；大鼠丙二醛                                取“2.3”项下各组大鼠剩余的BALF，按照相应试剂
         （malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide            盒说明书操作，采用 ELISA 法以酶标仪检测其中 IL-5、
          dismutase，SOD）试剂盒（货号分别为 J23786、J23069）均            IL-4、TNF-α水平。
          购自武汉吉立德生物科技有限公司；兔源SIRT1、磷酸化                        2.5 大鼠肺组织病理形态学观察
          AMPK（phosphorylated AMPK，p-AMPK）、甘油醛-3-磷               收集 BALF 后，对各组大鼠腹腔注射 4% 戊巴比妥
          酸脱氢酶（GAPDH）、AMPK、过氧化物酶体增殖物激活                       钠进行麻醉，采用脊椎脱臼法处死后收集双侧肺组织。
          受体 γ 共激活因子 1α（peroxisome proliferator-activated    取大鼠左肺组织适量，于4%多聚甲醛中固定24 h，经脱
          receptor-gamma co-activator factor-1α，PGC-1α）单克隆   水、二甲苯浸泡、石蜡包埋后切片；取切片，进行苏木精-
          抗体及辣根过氧物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白 G 二抗                          伊红（HE）染色，使用显微镜观察大鼠的肺组织病理形
         （货号分别为 ab189494、ab133448、ab181602、ab32047、          态学变化。
          ab313559、ab6721）均购自英国Abcam公司。                      2.6 大鼠肺组织中杯状细胞异常增生情况观察
          1.3 实验动物                                               取“2.5”项下各组大鼠左肺组织切片，进行 PAS，使
              SPF级幼年SD大鼠60只（雌雄各半），体重50～52 g，                 用显微镜观察杯状细胞异常增生情况并进行PAS评分，
          购自山东艾茂达康生命科学有限公司，动物生产许可证号                          具体标准为：未见杯状细胞异常增生，记0分；杯状细胞


          中国药房  2024年第35卷第20期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 20    · 2467 ·
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