Page 20 - 《中国药房》2024年20期

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癸益冲方14.175 g/kg ，同时腹腔注射等体积生理盐水； 1∶2 000、1∶4 000），4 ℃孵育过夜；加入对应二抗（稀释比
资癸益冲方+2-DG 组小鼠灌胃资癸益冲方 14.175 g/kg 例1∶5 000），室温摇床孵育1 h，洗膜，应用ECL化学发光
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和腹腔注射 2-DG 100 mg/kg ；正常组和模型组小鼠灌 法检测。使用Image J软件分析条带灰度值，以目的条带
胃等体积蒸馏水和腹腔注射等体积生理盐水，每日1次， 与内参（β-actin）的灰度值比值作为目的蛋白的表达量。
连续给药7 d。 2.8 小鼠卵巢组织中凋亡和糖酵解相关基因表达检测
2.2 样本采集 采用实时荧光定量 PCR 检测。取“2.2”项下各组 5
末次给药后行小鼠阴道脱落细胞涂片，选择动情前 只小鼠冻存的卵巢组织，按照试剂盒说明书提取 RNA，
期小鼠，予持续吸入异氟烷进行麻醉，眼球取血。血样 并测定RNA纯度及浓度，逆转录获取cDNA，配制qPCR
静置2 h，以3 500 r/min离心15 min，取上层血清，冻存备 反应体系（20 μL），包括 qPCR Mix 10 μL，正、反向引物
用。摘取小鼠双侧卵巢，每组取5个新鲜卵巢组织，置于 各 0.4 μL，Low ROX Dye 0.2 μL，DNA 模板 1 μL，无核
4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋、切片，备用；剩余卵巢组 酸酶水 8 μL。扩增条件为 95 ℃预变性 10 min；95 ℃变
织用液氮速冻后，转移至－80 ℃冰箱中保存，备用。 性 10 s，60 ℃延伸退火 30 s，共 40 个循环。以 β-actin 为
2.3 小鼠卵巢组织病理形态学观察及各级卵泡计数 内参基因，采用 2 －ΔΔCt 计算 Bcl-2、Bax、caspase-3、HK2、
取“2.2”项下各组5只小鼠冻存的卵巢组织切片，脱 PKM2、LDHA mRNA表达量，并以正常组为参照进行归
蜡、苏木精-伊红（HE）染色、脱水、透明、封固后，晾干，在 一化处理。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设
显微镜下观察卵巢组织病理形态；每张切片任选5个视 计、合成，引物序列与产物大小见表1。
野，对原始卵泡、生长卵泡、窦卵泡以及闭锁卵泡进行 表1 PCR引物序列与产物大小
计数。 基因 引物序列 产物大小/bp
2.4 小鼠血清中E2、FSH、AMH水平检测 Bcl-2 正向引物：5′-TGTAGAGAGGAGAACGCAGGTAGTG-3′ 83
反向引物：5′-GGCTTCTTCTTCTGTGTGGTG-GTC-3′
采用放射免疫法检测。取“2.2”项下各组10只小鼠
Bax 正向引物：5′-GCTACAGGGTTTCAT-CCAGGATCG-3′ 140
冻存的上层血清，按试剂盒说明书进行操作，检测血清 反向引物：5′-TGCTGTCCAGTTCATCTCCAATTCG-3′
中E2、FSH、AMH水平。 caspase-3 正向引物：5′-GAAACTCTTCATCATTCAGGCC-3′ 250
2.5 小鼠卵巢颗粒细胞凋亡检测 反向引物：5′-GCGAGTAAGAATGTGCATAAAT-3′
HK2 正向引物：5′-TGATCGCCTGCTTATTCACGG-3′ 112
采用TUNEL法检测。取“2.2”项下各组5只小鼠冻 反向引物：5′-AACCGCCTAGAAATCTCCAGA-3′
存的卵巢组织切片，按试剂盒说明书进行操作，加入 PKM2 正向引物：5′-GCCGCCTGGACATTGACTC-3′ 145
TUNEL工作液孵育和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） 反向引物：5′-CCATGAGAGAAATTCAGCCGAG-3′
LDHA 正向引物：5′-TGTCTCCAGCAAAGACTACTGT-3′ 155
染核后，采用活细胞显微成像仪观察卵巢颗粒细胞凋亡
反向引物：5′-GACTGTACTTGACAATGTTGGGA-3′
情况。使用Image J软件分析荧光强度，荧光强度越强， β-actin 正向引物：5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′ 154
表示卵巢颗粒细胞凋亡数量越多。 反向引物：5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′
2.6 小鼠卵巢组织中糖酵解关键酶活性检测 2.9 统计学方法
采用比色法检测。取“2.2”项下各组 5 只小鼠冻存 采用SPSS 26.0软件进行统计分析。符合正态分布
的卵巢组织，按质量体积比 1∶10（g/mL）加入 Extraction 的计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分
Buffer，在冰浴中匀浆，于 4 ℃以 8 000 r/min 离心 10 析；如方差齐，采用 LSD-t 检验进行两两比较；如方差不
min，收集上清液，采用 BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白 齐，则采用Dunnett’s T3检验。计数资料以百分率表示，
浓度。将收集的上清液以及按试剂盒说明书配制的工 组间比较采用χ 检验。检验水准α＝0.05。
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作液依次加入 96 孔板中，室温放置 20 s，采用酶标仪分 3 结果
别检测 HK、PK、LDH 在 450、340、450 nm 波长处的光密 3.1 各组小鼠卵巢组织病理形态学及各级卵泡数量
度（optical density，OD）值，记为 OD1，然后取出，再于室 比较
温放置 140 s，同法检测 OD 值，记为 OD2，计算其酶活 正常组小鼠卵巢组织可见各级卵泡发育良好，卵巢
性：酶活性＝3 215×（OD1－OD2）/Cpr，式中Cpr为测量 颗粒细胞层数多、排列密集；与正常组比较，模型组小鼠
值标准化常数。 卵巢组织中原始卵泡、生长卵泡、窦卵泡数量和卵巢颗
2.7 小鼠卵巢组织中凋亡和糖酵解相关蛋白表达检测 粒细胞层数均显著减少，闭锁卵泡数量显著增多（P＜
采用 Western blot 法检测。取“2.2”项下各组 5 只小 0.05）；与模型组比较，资癸益冲方组小鼠卵巢组织中原
鼠冻存的卵巢组织，加入蛋白裂解液，充分破碎和匀浆 始卵泡、生长卵泡、窦卵泡数量和卵巢颗粒细胞层数均
后，以 14 000 r/min 离心 10 min，提取蛋白，采用 BCA 蛋 显著增多，卵巢颗粒细胞排列整齐，闭锁卵泡数量显著
白定量试剂盒测定蛋白浓度，煮沸变性。取变性后的蛋 减少（P＜0.05）；与资癸益冲方组比较，资癸益冲方+2-DG
白样品进行电泳，转膜，脱脂牛奶封闭 2 h，加入 Bcl-2、 组小鼠卵巢组织中原始卵泡、生长卵泡、窦卵泡数量和
Bax、caspase-3、HK2、PKM2、LDHA、β-actin一抗（稀释比 卵巢颗粒细胞层数均显著减少，闭锁卵泡显著增多（P＜
例分别为 1∶2 000、1∶5 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000、 0.05）。结果见图1、表2。

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