Page 14 - 《中国药房》2024年20期
P. 14

同时设置各效靶比对应的效应细胞自然释放组（只加效                           （β-actin）的灰度值比值表示目的蛋白的表达量，再进一
          应细胞）、靶细胞自然释放组（只加靶细胞）、靶细胞最大                          步以 p-NF-κB p65 与 NF-κB p65、p-STAT-4 与 STAT-4 的
          释放组（加靶细胞和 LDH 释放剂）。培养结束前 1 h，在                      蛋白表达量比值表示 NF-κB、STAT-4 蛋白的磷酸化
          靶细胞最大释放组中加入LDH释放剂2 μL，于37 ℃避                        水平。
          光孵育 1 h。培养结束后，离心，吸出各孔等体积上清                          2.5 统计学方法
          液，加入到新的96孔板中，每孔加入LDH工作液60 μL，                           采用 SPSS 25 软件对数据进行统计分析。数据以
          混匀，室温下避光孵育 30 min；采用酶标仪检测 490 nm                    x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
          波长处各孔的 OD 值，计算杀伤活性：杀伤活性（%）＝                         比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
         （实验组 OD 值－效应细胞自然释放组 OD 值－靶细胞                         3 结果
          自然释放组OD）/（靶细胞最大释放组OD值－靶细胞自                          3.1 GiP及GiP-B1对荷瘤小鼠imDC的促成熟作用
          然释放组OD）×100%。                                       3.1.1 GiP及GiP-B1的给药浓度和作用时间
          2.4.4 共培养后荷瘤小鼠mDC中IL-12、IL-12R、STAT-4                   经 100 μg/mL GiP，50、100 μg/mL GiP-B1 干预 24 h
          mRNA表达检测                                            后，mDC 细胞活力分别为（133.45±15.16）%、（126.50±
              采 用 实 时 定 量 PCR 法 进 行 检 测 。 取 荷 瘤 小 鼠           13.17）%、（132.49±12.05）%（n＝3），均显著高于对照组
          imDC，按照“2.3.2”项下方法分组、给药、培养后，离心，                    （细胞活力为 100%）（P＜0.05），其中 100 μg/mL GiP-B1
          取荷瘤小鼠 mDC 接种于 Transwell 嵌套装置上室，将                    组的 mDC 细胞活力显著高于 50 μg/mL GiP-B1 组（P＜
                                    +
         “2.4.1”项下纯化后得到的CD4 T细胞接种于下室，共培                       0.05）。其余各组 mDC 细胞活力与对照组比较，差异均
          养比例为1∶5（根据“2.4.1”项下结果设置）。共培养24 h                    无统计学意义（P＞0.05）。故选择后续实验 GiP 及 GiP-
          后 ，收 集 并 提 取 Transwell 装 置 上 室 内 各 组 mDC 总          B1的给药浓度为100 μg/mL，作用时间为24 h。
          RNA，反转录为 cDNA，以上述 cDNA 为模板进行 PCR                    3.1.2 GiP 及 GiP-B1 对荷瘤小鼠 mDC 中表面标志物阳
                                                              性表达率的影响
          扩增。反应体系（20 μL）包含 cDNA 模板 4 μL，SYBR
          Green Master Mix 10 μL，正、反向引物各 0.4 μL，50×               与对照组比较，TNF-α 组、GiP 组与 GiP-B1 组荷瘤
                                                              小 鼠 mDC 中 MHC- Ⅱ 阳 性 表 达 率 均 显 著 升 高（P＜
          ROX Reference Dye 2 0.4 μL，ddH2O 4.8 μL。反应条件
                                                              0.05），CD11c、CD80、CD86 阳性表达率均有升高趋势，
          为：95 ℃预变性 10 min；95 ℃变性 15 s，60 ℃退火延伸
                                                              但与对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果
          60 s，共 40 个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）
          为内参，采用 2     －ΔΔCt 法计算 IL-12、IL-12R、STAT-4 mRNA     见表2、图1。
                                                              表2 各组荷瘤小鼠 mDC 中表面标志物阳性表达率比
          表达量。引物由擎科生物科技（北京）股份有限公司设
                                                                   较（x±s，n＝3，%%）
          计、合成，其序列及产物长度见表1。
                                                              组别        CD11c      CD80       CD86     MHC-Ⅱ
                  表1 PCR扩增引物序列及产物长度
                                                              对照组      46.40±6.17  76.40±8.26  71.27±16.94  60.77±2.66
           基因                引物序列（5′-3′）          产物长度/bp     TNF-α组   48.33±4.97  78.17±8.91  77.87±13.95  79.10±6.76 a
           GAPDH      正向引物：ATGGGTGTGAACCACGAGA      229       GiP组     48.30±4.95  89.63±9.22  87.13±8.32  80.27±3.15 a
                      反向引物：CAGGGATGATGTTCTGGGCA               GiP-B1组  50.87±3.62  91.23±8.98  87.40±10.28  83.57±5.14 a
           IL-12      正向引物：ATGTGGAATGGCGTCTC        111          a：与对照组比较，P＜0.05。
                      反向引物：GTCTCCTCGGCAGTTGG
           IL-12R     正向引物：CACCCCAGTGAACTACCTT      208       3.1.3 GiP 及 GiP-B1 对荷瘤小鼠 mDC 上清液中细胞因
                      反向引物：GGAGTCATAGCCCATCTTT                子水平的影响
           STAT-4     正向引物：AAACCTGAGCCCAACGA        145           与对照组比较，GiP 组与 GiP-B1 组荷瘤小鼠 mDC
                      反向引物：CAAAGCCGAAGAAATAA
                                                              上清液中IL-12p70、IL-4水平以及TNF-α组小鼠mDC上
          2.4.5 共培养后荷瘤小鼠 mDC 中 IL-12/NF-κB/STAT-4             清液中IL-4水平均显著升高（P＜0.05）。结果见表3。
          信号通路相关蛋白表达检测                                        3.2 GiP 及 GiP-B1 促成熟的荷瘤小鼠 mDC 的抗肿瘤
              采用Western blot法进行检测。取荷瘤小鼠mDC按                   作用及作用机制
          照“2.4.4”项下方法分组、给药、共培养 24 h 后，取 Tran‐                3.2.1 荷瘤小鼠mDC刺激CD4 T细胞增殖的作用及二
                                                                                         +
          swell装置上室内各组mDC，充分裂解，离心，取上清液，                       者共培养的最佳比例
          测定蛋白浓度后煮沸变性。取变性蛋白样品适量，经电                                荷瘤小鼠 mDC 与 CD4 T 细胞的比例分别为 1∶5、
                                                                                     +
          泳分离后转膜，封闭，加入 β-actin、NF-κB p65、p-NF-κB              1∶10、1∶20、1∶40 时，与对照组比较，TNF-α 组、GiP 组及
          p65、IL-12Rβ2、STAT-4、p-STAT-4 一抗（稀释比例分别为             GiP-B1组荷瘤小鼠mDC刺激CD4 T细胞增殖的刺激指
                                                                                           +
                                                                                                           +
          1∶5 000、1∶50 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000），  数均显著升高（P＜0.05），其中荷瘤小鼠 mDC 与 CD4 T
                                                                                                       +
          于4 ℃孵育过夜；加入相应二抗（稀释比例为1∶10 000），                     细胞的比例为1∶5时各组的刺激指数最大且CD4 T细胞
          室温下孵育 2 h；以化学发光法显色，采用 Image-Pro                     增殖最显著（表 4）。故选择后续实验荷瘤小鼠 mDC 与
                                                                 +
          Plus 6.0 软件分析蛋白条带。以目的蛋白与内参蛋白                        CD4 T细胞的共培养比例为1∶5。

          · 2456 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 20                            中国药房  2024年第35卷第20期
   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19