Page 13 - 《中国药房》2024年20期
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1.4 细胞株                                            项下方法分组、给药（GiP 及 GiP-B1 的给药浓度均 100
              小鼠肝癌细胞H22（批号CL-0341）购自武汉普诺赛                    μg/mL），作用时间为24 h（根据“2.3.1”项下结果设置）。
          生命科技有限公司。                                          培养结束后，收集细胞，离心，弃上清液，用 PBS 洗涤 2
          2 方法                                               次，重悬，分别加入 CD11c、CD80、CD86、MHC-Ⅱ单克
          2.1 H22细胞培养上清液及H22冻融抗原的制备                          隆抗体各 2 μL，4 ℃下避光孵育 30 min；用 PBS 洗去未
              用含 10% 胎牛血清、1% 双抗的 RPMI-1640 完全培               结合的抗体，离心，弃上清液；细胞用 PBS 重悬，采用流
          养基，在 37 ℃、5%CO2培养箱中培养 H22 细胞，待细胞                   式细胞仪和 Flow Jo 10.8.1 软件检测细胞中 CD11c、
          长至 80%～90% 时即可传代。待 H22 细胞呈对数生长                     CD80、CD86、MHC-Ⅱ阳性表达率。
          期时，收集细胞，离心，取上清液置于－80 ℃冰箱中保                         2.3.3 荷瘤小鼠 mDC 上清液中 IL-12p70、IL-4 水平的
          存，备用。取细胞沉淀，用RPMI-1640完全培养基重悬，                      检测
                         7
          调整密度为 1×10 个/mL，反复冻融 5 次，离心，取上清                        采用 ELISA 法进行检测。按照“2.3.2”项下方法分
          液即为H22冻融抗原；留少许冻融抗原置于冰上测抗原                          组、给药、培养后，收集细胞培养上清液，按照 ELISA
          浓度，其余冻融抗原置于－80 ℃冰箱中保存，备用。                          试剂盒说明书方法操作，采用酶标仪检测上清液中
          2.2 荷瘤小鼠造模与imDC的制备                                 IL-12p70、IL-4水平。
              取对数生长期的 H22 细胞，离心，取细胞沉淀，用                      2.4 GiP 及 GiP-B1 促成熟的荷瘤小鼠 mDC 的抗肿瘤
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          PBS调整密度为1×10 个/mL，然后取5只健康昆明种雌                      作用及机制研究
                                                                                        +
          性小鼠，均于腹腔接种0.2 mL以保种传代。腹腔传代第                        2.4.1 荷瘤小鼠mDC刺激CD4 T细胞增殖的作用及二
          5天，抽取乳白色腹水，洗涤，重悬，再次接种到另外5只                         者共培养比例的筛选
          健康昆明种雌性小鼠腹腔，连续传 3 代，抽取腹腔生长                             在无菌条件下取出健康C57BL/6雄性小鼠脾脏，分
          旺盛的腹水 H22 细胞，洗涤，用 PBS 调整密度为 1×10               7   离脾淋巴细胞，借助磁珠分选试剂盒筛选、纯化后得
                                                                 +
          个/mL。随后取 12 只健康 C57BL/6 雄性小鼠，均于右腋                  CD4 T 细胞。取荷瘤小鼠 imDC，按照“2.3.2”项下方法
          皮下注射该细胞悬液0.1 mL，以腋下形成黄豆粒大小的                        分组、给药、培养后，离心，收集细胞（即荷瘤小鼠mDC）。
                                                                                  +
          包块作为荷瘤小鼠造模成功。                                      取荷瘤小鼠 mDC 与 CD4 T 细胞，以每孔各 100 μL 接种
              将造模成功的荷瘤小鼠颈椎脱臼处死，在无菌条件                         于96孔板中，二者比例分别为1∶5、1∶10、1∶20、1∶40（以
          下取出股骨和胫骨，剪去骨头两端，用 RPMI-1640 基础                     细胞数量计，下同），每组设3个复孔；同时设置刺激细胞
          培养基冲洗骨髓腔内细胞至骨髓变白，然后反复吹打骨                           对照组（只接种荷瘤小鼠mDC，用于观察细胞活力）与反
                                                                                     +
          髓细胞悬液，过滤，洗涤，离心，取上清液用imDC完全培                        应细胞对照组（只接种 CD4 T 细胞）。共培养 24 h 后生
          养基重悬细胞，在 CO2恒温培养箱中静置培养 48 h 后，                     成CD4-细胞毒性T细胞（CD4-CTL），加入含10%CCK-8
          用含20%H22细胞培养上清液的imDC完全培养基全量                        试剂的培养基，于37 ℃避光孵育2 h。采用酶标仪检测
          换液，第4天半量换液，培养至第6天的细胞即为荷瘤小                          450 nm 波长处各孔的 OD 值，计算刺激指数：刺激指
          鼠imDC。                                             数＝（实验组 OD 值－培养基对照的 OD 值）/（反应细胞
          2.3 GiP 及 GiP-B1 对荷瘤小鼠 imDC 促成熟作用的                 对照组OD值－培养基对照的OD值）。刺激指数越大，
                                                                 +
          研究                                                 CD4 T细胞增殖越明显，说明经GiP及GiP-B1促成熟的
                                                                                          [10]
          2.3.1 GiP及GiP-B1给药浓度和作用时间的筛选                       mDC 具有刺激活化 T 细胞的能力 。根据检测结果筛
                                                                                  +
              采用 CCK-8 法进行检测。取“2.2”项下荷瘤小鼠                    选荷瘤小鼠mDC与CD4 T细胞共培养的最佳比例。
          imDC，以 2×10 个/孔接种于 96 孔板中，分为对照组、                   2.4.2 CD4-CTL 上清液中 IL-12p70、IFN-γ、IL-4、IL-10
                       4
                           [9]
          TNF-α 组（20 ng/mL ）、GiP 及 GiP-B1 不同质量浓度组            水平的检测
         （50、100、200、400 μg/mL），每组设 3 个复孔。各孔加入                   采用 ELISA 法进行检测。按照“2.4.1”项下方法分
                                                                                                +
          含或不含相应药物的imDC完全培养基培养24、48 h，培                      组、给药、共培养，荷瘤小鼠 mDC 与 CD4 T 细胞共培养
          养结束前 4 h，各孔加入 4 μg/mL H22 冻融抗原；培养结                 的比例为1∶5（根据“2.4.1”项下结果设置）。共培养24 h
          束后，加入含10%CCK-8试剂的培养基，于37 ℃避光孵                      后，收集细胞培养上清液，按照 ELISA 试剂盒说明书
          育 2 h。采用酶标仪测定 450 nm 波长处各孔 mDC 的光                  方法操作，采用酶标仪检测上清液中 IL-12p70、IFN-γ、
          密度（optical density，OD）值，计算细胞活力：细胞活力                IL-4、IL-10水平。
         （%）＝（实验组 OD 值－培养基对照的 OD 值）/（对照组                     2.4.3 CD4-CTL对H22细胞的杀伤活性检测
          OD 值－培养基对照的 OD 值）×100%。根据检测结果                          按照“2.4.2”项下方法分组、给药、共培养24 h后，收
          筛选GiP及GiP-B1的最佳给药浓度和作用时间。                          集悬浮细胞（即CD4-CTL）。取CD4-CTL（效应细胞）和
          2.3.2 荷瘤小鼠mDC中表面标志物阳性表达率的检测                        H22细胞（靶细胞），以每孔各100 μL接种于96孔板中，
              采用流式细胞术进行检测。取“2.2”项下荷瘤小                        效应细胞与靶细胞比（以下简称“效靶比”）分别为10∶1、
                         6
          鼠 imDC，以 1×10 个/孔接种于 6 孔板中，按照“2.3.1”               20∶1、50∶1（以细胞数量计），培养24 h，每组设3个复孔；

          中国药房  2024年第35卷第20期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 20    · 2455 ·
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