Page 19 - 《中国药房》2024年20期

number of atretic follicles and granulosa cells apoptosis were decreased significantly in Zigui yichong formula group （P＜0.05）； the
serum levels of E2 and AMH， the activities of HK， PK and LDH， protein and mRNA expressions of Bcl-2， HK2， PKM2 and
LDHA were increased significantly （P＜0.05）； the serum levels of FSH， the protein and mRNA expressions of Bax and caspase-3，
Bax/Bcl-2 ratio were decreased significantly （P＜0.05）. 2-DG could reverse the improvement effects of Zigui yichong formula on
the above indexes of POI model mice. CONCLUSIONS Zigui yichong formula may inhibit the apoptosis of ovarian granulosa
cells， reduce follicle atresia and improve ovarian reserve function by promoting glycolysis levels in POI model mice.
KEYWORDS premature ovarian insufficiency； Zigui yichong formula； glycolysis； ovarian granulosa cells； cell apoptosis

早 发 性 卵 巢 功 能 不 全（premature ovarian insuffi‐ 21061081、21101822）均由神威药业集团有限公司提供。
ciency，POI）是指女性 40 岁以前出现卵巢功能减退，以 环磷酰胺（批号 WXBDO289V，纯度≥98%）购自美
月经不调、闭经、促性腺激素升高和雌激素水平波动性 国 Sigma 公司 ；2-脱氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-arabino-
[1]
降低为主要表现 。卵巢颗粒细胞异常凋亡导致的卵泡 hexose，2-DG）（批号 HY-13966，纯度 99.93%）购自美国
[2]
闭锁加速是诱发 POI 的重要机制 。在卵泡发育过程 MCE 公司；雌二醇（estradiol，E2 ）试剂盒、卵泡刺激素
中，卵母细胞利用卵巢颗粒细胞糖酵解产生丙酮酸和乳 （follicle-stimulating hormone，FSH）试剂盒（批号分别为
酸，并将其作为能量底物，以促进卵泡的生长、发育和成 S10950204、S10950198）均购自天津市协和医药科技有
[3]
熟 。卵巢颗粒细胞糖酵解水平降低会延缓卵泡的发 限公司；血清抗米勒管激素（anti-Müllerian hormone，
育，加速卵泡闭锁，最终导致 POI 发生发展 。因此，笔 AMH）试剂盒（批号 HY-10659）购自北京华英生物技术
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者推测，糖酵解能力不足诱导的卵巢颗粒细胞凋亡可能 研究所；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒、己糖激酶（hexo‐
是导致POI发生的机制之一。 kinase，HK）试剂盒、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）试
资癸益冲方是第六、七批全国老中医药专家学术经 剂盒、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒
验继承工作指导老师杜惠兰教授的临床经验用方，该方 （批号分别为 ATWH17081、ATWE11101、ATWD25101、
由熟地黄、紫河车、山萸肉、女贞子、枸杞子、白芍、黄芪、 ATWE18101）均购自亚科因（武汉）生物技术有限公司；
党参、白术、当归、香附、炙甘草组成，具有补肾填精、疏 兔源B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗体、鼠
肝理脾之效，其治疗卵巢功能减退性疾病的临床疗效显 源 Bcl-2 相关 X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗
著 。本课题组前期研究证实，资癸益冲方可改善 POI 体、鼠源胱天蛋白酶-3（caspase-3）抗体、兔源HK2抗体、
[5]
模型小鼠的血清激素水平，减少卵巢颗粒细胞的凋亡， 兔源M2型PK（pyruvate kinase M2，PKM2）抗体、兔源乳
[6]
减少卵泡闭锁，保护卵巢储备功能 。但该方是否通过 酸脱氢酶 A（lactate dehydrogenase A，LDHA）抗体（批号
调控糖酵解减少POI模型小鼠卵巢颗粒细胞凋亡，进而 分别为26593-1-AP、60267-1-lg、66470-2-lg、22029-1-AP、
保护卵巢储备功能尚不明确。为此，本研究基于糖酵解 15822-1-AP、19987-A-AP）均购自美国 Proteintech 公司；
代谢途径探讨了资癸益冲方对 POI 模型小鼠卵巢储备 RNA提取试剂盒（批号R6831-01）购自美国Omega公司；
功能的影响，以期为防治POI提供新的实验依据和治疗 逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒（批号分别为MR05101M、
靶点。 MQ00401S）均购自莫纳（苏州）生物科技有限公司。
1 材料 1.3 实验动物
1.1 主要仪器 SPF 级 C57BL/6N 雌性小鼠 80 只，7～8 周龄，体重
本研究所用主要仪器包括 Image Quant LAS 4000 16～19 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动
型化学发光成像系统（美国 GE 公司）；BX53 型显微镜 物生产许可证号为 SCXK（京）2021-0006。所有动物均
（日本 Olympus 公司）；NanoDrop 2000 型分光光度计、 饲养于河北中医药大学 SPF 级实验动物中心，室内温
7500 Fast 型实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪、 度（24±2）℃，相对湿度 40%～70%，光照时间 08：00－
AMAFD1000 型活细胞显微成像仪（美国 Thermo Fisher 20：00，适应性喂养7 d。本实验经河北中医药大学伦理
Scientific 公司）；Gel Logic 100 型凝胶电泳系统（美国 委员会审核批准，批件编号DWLL202302006。
Bio-Rad 公司）；FJ-2021 型 γ-放射免疫计数器（西安核 2 方法
仪器厂）；Versa Max 型多功能酶标仪（美国 Molecular 2.1 分组、造模与给药
Devices公司）。 根据随机数字表法将 80 只小鼠分为正常组、模型
1.2 主要药品与试剂 组、资癸益冲方组和资癸益冲方+2-DG（糖酵解抑制剂）
资癸益冲方配方颗粒购自神威大药房，其中熟地 组，每组20只。除正常组外，其余各组小鼠一次性腹腔
黄、紫河车、山萸肉、女贞子、枸杞子、白芍、黄芪、党参、 注射环磷酰胺 75 mg/kg 诱导 POI 模型，从造模第 2 天起
白术、当归、香附、炙甘草均为免煎配方颗粒（批号分别 每天10：00行阴道脱落细胞涂片，观察2个动情周期，若
为 21102341、21072661、21092031、21080771、21081731、 阴道上皮细胞无动情周期变化或周期延长、紊乱，则提
[7]
21093011、21081731、21102831、21101341、21092821、 示造模成功 。造模成功后，资癸益冲方组小鼠灌胃资

中国药房 2024年第35卷第20期 China Pharmacy 2024 Vol. 35 No. 20 · 2461 ·