Page 36 - 《中国药房》2024年17期
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1.3 动物                                              10%～＜20% 为 3 分，减少 20% 及以上为 4 分；便血——
              本研究所用动物为 SPF 级雄性 C57BL/6J 小鼠，共                  未出血为0分，略微带血为1分，较少带血为2分，较多带
          24 只，体重 20～22 g，购自斯贝福（北京）生物科技有限                     血为 3 分，大量带血为 4 分；粪便硬度——正常粪便为 0
          公司，动物生产许可证号为SCXK（京）2019-0010。实验                     分，轻微稀便为1分，稀便为2分，水样稀便为3分，严重
                                                                                                       [13]
          前，所有动物均饲养于温度18～22 ℃、相对湿度50%～                        拉稀为4分。DAI＞0.5则表明UC模型复制成功 。
          60%、光明 12 h/黑暗 12 h 交替的环境下，饲养期间自由                   2.2.3 样本采集
          摄食、饮水，适应性喂养1周后进行后续实验。本研究方                               末次给药后 1 d，用 1% 戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉
          案经云南中医药大学动物实验伦理委员会审查合格，批                            小鼠，眼眶取血。将血样在室温放置1 h后，在4 ℃下以
          准号为R-062023111。                                     3 000 r/min 离心 15 min，分离血清。采用颈椎脱位法处
          2 方法                                                死小鼠，打开腹腔，完整取出结肠组织，测量结肠长度
          2.1 网络药理学与分子对接预测 KSCF 干预 UC 潜在                      后，将部分结肠组织用4%多聚甲醛溶液固定，另一部分
          靶点                                                  结肠组织于－80 ℃下保存；此外，采集新鲜脾脏用于 T
          2.1.1 KSCF治疗UC核心靶点预测                                淋巴细胞亚群分析，收集结肠内容物用于肠道菌群多样
              经 Swiss  Target  Prediction、GeneCards、OMIM 和    性测序。
          Drug Bank 数据库检索 KSCF 与 UC 的相关靶点。借助                  2.2.4 血清中 LPS 及结肠组织中 MPO、NO、SOD 水平
          Venny 2.1 在线绘图工具获取 KSCF 与 UC 交集靶点，并                 检测
          应用 DAVID 数据库对交集靶点进行基因本体（gene on‐                        按试剂盒说明书方法检测小鼠血清中 LPS 水平。
          tology，GO）功能注释及京东基因与基因组百科全书                         取各组小鼠冻存的结肠组织10 mg于EP管中，加入100
         （Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路     µL 预冷的磷酸盐缓冲液（pH7.4），匀浆，于 4 ℃下以
          富集分析，从而揭示 KSCF 与 UC 相关靶点的生物学                        12 000 r/min 离心 15 min，收集上清液，分别按相应试剂
          联系。                                                 盒说明书方法检测小鼠结肠组织中MPO、NO、SOD水平。
          2.1.2 KSCF-核心靶点分子对接验证                               2.2.5 结肠组织病理形态学变化观察
              从 PubChem 数据库和 PDB 数据库中获取 KSCF 和                    在 4% 多聚甲醛固定的结肠组织中，每组取 3 个结
          核心靶点蛋白的3D结构，随后使用Discovery Studio 3.5                肠组织样本制备石蜡切片（厚度 4 μm），分别按 HE 和
          软件进行结构预处理，包括加氢、电荷计算和非极性氢                            AB-PAS 染色试剂盒说明书方法进行染色后，在病理切
          原子合并。通过AutoDock Vina 1.1.2软件对KSCF配体                 片扫描仪下观察并采集图像。
          与核心靶点受体进行分子对接，并预测 KSCF 与受体的                         2.2.6 结肠组织中occludin、ZO-1表达检测
          结合模式与亲和力。                                               每组取3个石蜡切片样本，经抗原修复后，在4 ℃下
          2.2 KSCF对UC小鼠免疫应答及相关生理指标的影响                         与occludin、ZO-1一抗（稀释比例均为1∶100）孵育过夜，
          2.2.1 动物分组、造模与给药                                    复温洗涤后滴加 HRP 标记的兔源二抗染液（稀释比例
              将 24 只小鼠按体重随机分为 4 组，分别为正常组、                     1∶100）；洗涤后使用二氨基联苯胺法进行显色，随后加
          模型组、阳性对照组和KSCF组，每组6只。正常组小鼠                          入苏木精进行细胞核复染，最后用中性树胶封片。在病
          正常饮用水，其余各组小鼠均饮用 3% 的 DSS 溶液 7 d，                    理切片扫描仪下采集图像信息，细胞核为蓝色，occludin、
                            [8]
          以建立 UC 小鼠模型 。造模期间，KSCF 组小鼠灌胃                        ZO-1阳性表达为棕黄色。运用Image J软件进行半定量
                                                  [12]
          KSCF 100 mg/kg（给药剂量根据前期研究结果 设置），                    分析，结果以阳性区域百分比展示。
          阳性对照组小鼠灌胃柳氮磺胺吡啶703 mg/kg[根据成人                       2.2.7 结肠组织中炎症反应相关蛋白表达检测
         （体重 70 kg）临床剂量换算而得]，正常组和模型组小鼠                            每组取3只小鼠冻存的结肠组织适量，加入RIPA裂
          灌胃等体积药物溶剂。灌胃体积均为 10 mL/kg，每天 1                      解液，于 4 ℃下研磨后，于冰上放置 30 min，然后以
          次，连续 7 d。所有灌胃药液均以 N，N-二甲基乙酰胺                        3 500 r/min 离心 15 min，收集上清液，以 BCA 法测定蛋
         （2.5%）+吐温80（2.5%）+生理盐水的混合溶液为溶剂。                      白浓度后作变性处理。取变性蛋白样品，经十二烷基硫
          2.2.2 体重和疾病活动指数检测                                   酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转膜，封闭；加入NF-
              实验过程中，每天给药前称定并记录小鼠体重，观                          κB p65、p-NF-κB p65、NLRP3、β-actin 一抗（稀释比例均
                                                [13]
          察其粪便成形和带血情况。参照文献方法 计算各组                             为1∶1 000），于4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入HRP标记
          大 鼠 的 疾 病 活 动 指 数（disease  activity  index，DAI），    的兔源二抗（稀释比例 1∶5 000），室温孵育 2 h；洗膜 3
          DAI＝（体重减少比例评分+便血评分+粪便硬度评分）/                         次，使用Chemidoc XRS图像检测仪观察蛋白条带，使用
          3。具体标准为：体重减少比例——无减少为 0 分，减少                         Image J软件分析目的条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋
          1%～＜5% 为 1 分 ，减 少 5%～＜10% 为 2 分 ，减 少                白（β-actin）条带的灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。


          · 2090 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 17                            中国药房  2024年第35卷第17期
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