Page 63 - 《中国药房》2024年15期
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ng/mL  PDGF-BB+10  mg/mL  Thp+NC-siNrf2），PDGF-     2.3.5 细胞中Nrf2和HO-1蛋白表达检测
          BB+siNrf2 组（25 ng/mL PDGF-BB+siNrf2），PDGF-BB+          采用 Western blot 法检测。将处于对数生长期的
          Thp+siNrf2 组（25  ng/mL  PDGF-BB+10  mg/mL  Thp+    VSMCs 以 2.0×10 个/mL 的密度接种于 6 孔细胞培养
                                                                             5
          siNrf2），每 组 设 5 个 复 孔 。 Nrf2 的 siRNA 序列为：          板中，2.0 mL/孔。按“2.2（1）”项下方法分组、给药。培
          5′-GGCAUUUCACUAAACACAATT-3′。                       养 48 h 后，收集细胞，用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂
          2.3 Thp 抑制 PDGF-BB 诱导 VSMCs 氧化应激损伤的                解液处理细胞，提取细胞中总蛋白，采用 BCA 法检测
          效应研究                                               总蛋白浓度。将蛋白变性处理后，通过 10% 十二烷基
          2.3.1 VSMCs的增殖能力检测                                 硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，用湿转法
             （1）采用 CCK-8 法检测。将处于对数生长期的                      （电流为 220 mA）将分离的蛋白质转移至聚偏二氟乙
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          VSMCs 以 2.0×10 个/mL 的密度接种于 96 孔细胞培养                烯膜上，在室温条件下用 5% 脱脂奶粉封闭 1.5 h；加
          板中，100 μL/孔。按“2.2（1）”项下方法分组、给药，并另                  入 Nrf2、HO-1 和 β-actin 一抗（稀释比例分别为 1∶200、
          设空白孔调零。培养 48 h 后，每孔加入 CCK-8 溶液 100                 1∶200、1∶1 000），4 ℃孵育过夜；洗膜后，加入二抗（稀释
          μL，振荡混匀后，在 37 ℃、5%CO2培养箱中孵育 4 h，使                  比例为 1∶2 000），在室温条件下孵育 1 h；加入化学发光
          用酶标仪检测各孔在 450 nm 波长处的光密度（optical                   剂，采用全自动凝胶成像系统进行拍照，利用 Gel-Pro
          density，OD）值。                                      Analyzer软件分析蛋白条带的灰度值。目的蛋白的相对
             （2）采 用 EdU 法 检 测 。 将 处 于 对 数 生 长 期 的            表达量＝目的蛋白的条带灰度值/内参蛋白（β-actin）的
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          VSMCs 以 2.0×10 个/mL 的密度接种于 24 孔细胞培养                条带灰度值。
          板中，400 μL/孔。按“2.2（1）”项下方法分组、给药。培                   2.4 Thp 抑制 PDGF-BB 诱导 VSMCs 氧化应激损伤的
          养48 h后，更换含有EdU的培养基继续孵育2 h，然后按                      机制研究
                                                                                                    5
          照 EdU 细胞增殖检测试剂盒说明书进行固定和染色。                             将处于对数生长期的 VSMCs 以 2.0×10 个/mL 的
          在显微镜下观察，随机选取5个视野进行拍照采样，然后                          密度接种于6孔细胞培养板中，2.0 mL/孔。待细胞生长
          计算 EdU 染色阳性细胞数量（EdU 染色阳性细胞为                        密度为 50%～60% 时，进行转染。按“2.2（2）”项下方法
          红色）。                                               分组、给药，收集各组细胞。按照“2.3”项下方法分别检
          2.3.2 VSMCs的迁移能力检测                                 测VSMCs的增殖、迁移能力，氧化应激水平，以及Nrf2、
              采用 Transwell 实验检测。取处于对数生长期的                    HO-1蛋白表达情况。
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          VSMCs，制备细胞密度为 2.0×10 个/mL 的细胞悬液。                   2.5 统计学方法
          取 100 μL 细胞悬液加入 Transwell 小室的上室，下室加                    采用 GraphPad Prism 6.0 软件对数据进行统计分
          入含 15% 胎牛血清的 DMEM 培养基 500 μL，按“2.2                 析。符合正态分布的计量资料以x±s表示，多组间比较
         （1）”项下方法分组、给药。培养48 h后，取出上室，用磷                       采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验。
          酸盐缓冲液（PBS）清洗3次，多聚甲醛固定20 min，风干                     检验水准α＝0.05。
          后用 0.1% 结晶紫染色 30 min。在显微镜下随机选取 5                   3 结果
          个视野拍照并计数穿膜细胞数。                                     3.1 效应研究实验结果
          2.3.3 细胞中ROS水平检测                                   3.1.1 Thp对PDGF-BB诱导的VSMCs增殖的影响
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              将处于对数生长期的VSMCs细胞以2.0×10 个/mL                       与对照组比较，PDGF-BB 组 VSMCs 的 OD 值显著
          的密度接种于 24 孔细胞培养板中，400 μL/孔。按“2.2                   升高（P＜0.01），EdU 染色阳性细胞数量显著增加（P＜
         （1）”项下方法分组、给药。培养48 h后，收集细胞，按照                       0.01）；与 PDGF-BB 组 比 较 ，Thp 低 、中 、高 浓 度 组
          ROS试剂盒说明书步骤操作，加入10 μmol/L DCFH-DA                  VSMCs 的 OD 值均显著降低（P＜0.01），EdU 染色阳性
          荧光探针避光孵育30 min，用PBS洗涤3次，上流式细胞                      细胞数量均显著减少（P＜0.01），且具有浓度依赖性趋
          仪检测（激发波长488 nm、发射波长525 nm），以相对平                    势。结果见图1、表1。
          均荧光强度表示细胞中ROS水平。                                   3.1.2 Thp对PDGF-BB诱导的VSMCs迁移的影响
          2.3.4 细胞中SOD、CAT活性检测                                   与对照组[穿膜细胞数为（48.69±0.08）个，n＝5]比
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              将处于对数生长期的 VSMCs 以 2.0×10 个/mL 的                较，PDGF-BB组的穿膜细胞数[（189.64±0.07）个，n＝5]
          密度接种于24孔细胞培养板中，400 μL/孔。按“2.2（1）”                  显著增加（P＜0.01）；与PDGF-BB组比较，Thp低、中、高
          项下方法分组、给药。培养 48 h 后，收集细胞，按照                        浓度组的穿膜细胞数[分别为（142.33±0.05）、（111.24±
          SOD、CAT 试剂盒说明书方法操作，测定细胞中 SOD、                      0.09）、（81.31±0.08）个，n＝5]均显著减少（P＜0.01），且
          CAT活性。                                             具有浓度依赖性趋势。结果见图2。


          中国药房  2024年第35卷第15期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 15    · 1857 ·
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