Page 39 - 《中国药房》2024年15期
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40%～70%的动物房内，自由摄食、饮水。本实验方案通                        水后，根据 Masson 三色染色液说明书操作，经浸泡、烘
          过广西中医药大学实验动物福利伦理委员会审批，批准                           烤、冲洗、浸染、沥干、染色、脱水、封片后，使用显微镜观
          编号为DW20220907-211。                                 察心肌纤维化程度并采集图像。
          2 方法                                               2.5 大鼠梗死心肌组织线粒体形态观察
          2.1 药液的配制                                              使用透射电镜观察。取“2.3”项下各组大鼠固定好
              取组方中药饮片，由广西中医药大学第一附属医院                         的梗死心肌组织适量，进行石蜡包埋、切片，脱蜡后，进
          制剂中心按下法统一煎煮：取炮附子，加10倍量水，浸泡                         一步切成 70～90 nm 的超薄切片，经铀-铅双染色后，使
          30 min后文火浓煎2 h，煎液过滤、浓缩后得炮附子煎煮                      用透射电镜对线粒体形态进行观察并拍照。
          液 15 mL；取其余中药饮片，混匀后加 10 倍量水，浸泡                     2.6 大鼠梗死心肌组织中 Bax、Bcl-2、TBK1、p62 蛋白
          30 min 后文火浓煎 40 min，煎液过滤后浓缩至 200 mL；               表达的检测
          将该浓缩液与炮附子煎煮液混合，得质量浓度为 0.665                            采用Western blot法检测。取“2.3”项下各组大鼠冻
                                                             存的梗死心肌组织适量，加入预冷的高效 RIPA 组织/细
          g/mL（以生药量计）的强心汤药液，备用。
                                                             胞裂解液充分匀浆，离心后取上清液，以BCA蛋白定量
              取卡托普利片，粉碎后用生理盐水溶解并稀释，制
                                                             试剂盒测定蛋白浓度后作变性处理；取变性蛋白适量，
          得质量浓度为1 mg/mL的混悬液，备用。
                                                             进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至聚偏二氟乙烯
          2.2 造模、分组与给药
                                                             膜上，以5%脱脂奶粉封闭；以TBST缓冲液洗膜后，加入
                                               [12]
              大鼠适应性喂养 7 d 后，参考相关文献 方法建立
                                                             GAPDH、Bax、Bcl-2、TBK1、p62 一抗（稀释比例均为 1∶
          CHF模型：大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠3.5 mg/kg麻醉
                                                             1 000），4 ℃下孵育；以 TBST 缓冲液洗膜后，加入二抗
          后，以仰卧位固定，连接心电图机并行气管插管机械通
                                                            （稀释比例为1∶5 000），37 ℃下孵育；以TBST缓冲液洗
          气，于前胸部以碘伏消毒备皮，打开胸廓，在左心耳下与
                                                             膜 3 次后，加入 ECL 工作液显影，再置于超高灵敏度化
          肺动脉根部约1.5 mm处迅速穿线结扎左冠状动脉前降
                                                             学发光成像系统下曝光成像。使用Image J 1.52软件对
          支，待心电图监测提示 ST 段抬高后将心脏回纳胸腔并
                                                             蛋白条带进行定量分析，以GAPDH为内参，计算目的蛋
          关胸逐层缝合。术后2周，若心脏彩超检查示大鼠左室
                                                             白与内参蛋白的灰度值比值，用以表示目的蛋白的相对
                                                     [12]
          射血分数下降20%～30%，则判定CHF模型建立成功 。
                                                             表达量（结果以假手术组为参照进行归一化处理）。
              将造模成功的大鼠按随机数字表法分为模型组、强
                                                             2.7 统计学方法
          心汤组、卡托普利组、强心汤+卡托普利组，每组8只；同
                                                                 采用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。所有数
          时，另取正常大鼠8只，仅于左冠状动脉前降支穿线但不
                                                             据均以 x±s 表示，组间比较采用单因素方差分析，进一
          结扎，作为假手术组。从造模成功次日开始，强心汤组
                                                             步两两比较采用 LSD-t 检验（方差齐）或 Tamhane’s T2
          大鼠灌胃强心汤药液12.25 g/（kg·d）（按生药量计，剂量
                                                             检验（方差不齐）。检验水准α＝0.05。
          根据成人与大鼠等效剂量换算公式计算而得），卡托普
                                                             3 结果
          利组大鼠灌胃卡托普利混悬液10.38 mg/（kg·d）（剂量根
                                                             3.1 各组大鼠梗死心肌组织中ATP、AMP、FFA水平检
          据成人与大鼠等效剂量换算公式计算而得），强心汤+卡
                                                             测结果
          托普利组大鼠灌胃强心汤药液和卡托普利混悬液（剂量
                                                                 与假手术组比较，模型组大鼠梗死心肌组织中ATP
          同各单药组）；假手术组和模型组大鼠灌胃生理盐水 2                          水平显著降低（P＜0.05），AMP、FFA 水平均显著升高
          mL。每天分2次灌胃，连续28 d。                                （P＜0.05）；与模型组比较，各药物组大鼠梗死心肌组织
          2.3 大鼠梗死心肌组织中ATP、AMP、FFA水平检测                       中ATP水平均显著升高（P＜0.05），AMP、FFA水平均显
              采用 ELISA 法检测。末次给药后，按“2.2”项下方                   著降低（P＜0.05）；与强心汤组和卡托普利组比较，强心
          法将各组大鼠麻醉，开胸取出心脏，用 4 ℃生理盐水清                         汤+卡托普利组大鼠梗死心肌组织中ATP水平显著升高
          洗2～3次后切取左心室梗死心肌组织（假手术组大鼠取                         （P＜0.05），AMP、FFA水平均显著降低（P＜0.05）。结果
          左心室相同部位心肌组织，下同），一部分于－80 ℃下冻                        见表1。
          存，另一部分于4%多聚甲醛中固定，备用。取各组大鼠                          3.2 各组大鼠梗死心肌组织Masson染色结果
          冻存的梗死心肌组织适量，用磷酸盐缓冲液充分匀浆                                假手术组大鼠心肌组织细胞排列整齐，细胞质丰富
          后，以3 000 r/min离心20 min，取上清液，使用酶标仪于                 均匀且间质正常，未见明显梗死灶，未见纤维化结构。
          450 nm 波长处检测吸光度值并根据试剂盒说明书中的                        模型组大鼠心肌组织细胞排列错乱，可见明显的心肌纤
          标准曲线法计算血清中ATP、AMP、FFA水平。                           维化。与模型组比较，强心汤组和卡托普利组大鼠心肌
          2.4 大鼠梗死心肌组织纤维化程度观察                                细胞排列相对整齐，心肌纤维化程度减轻；强心汤+卡托
              采用Masson染色法观察。取“2.3”项下各组大鼠固                    普利组大鼠心肌细胞排列整齐，心肌纤维化程度较各单
          定好的梗死心肌组织适量，进行石蜡包埋、切片，脱蜡至                          药组更轻。结果见图1。


          中国药房  2024年第35卷第15期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 15    · 1833 ·
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