Page 40 - 《中国药房》2024年12期
P. 40

+
                                        +
          30 min。采用流式细胞术对 CD44 /CD133 细胞比例和                   2.4 斑马鱼胚胎毒性实验
          SOX2阳性细胞率进行测定，该比例（率）数值越小，表示                             收集健康斑马鱼胚胎，随机分为对照组（只含胚胎
          目的蛋白的阳性表达越弱，肿瘤干细胞的分化程度                              养殖水）、溶剂组（0.1% 二甲基亚砜溶液）、ATRA 组（10
          越高。                                                 μmol/L）、小檗碱组（10 μmol/L），每组设 3 个复孔。在
          2.2.4 肿瘤干细胞肿瘤球破坏实验                                  12 孔板中每孔随机放入 10 个斑马鱼胚胎，于 28.5 ℃培
              参照“2.2.2”项下分组，根据“2.2.1”项下结果设置药                  养箱中培养。以受精卵凝固、缺乏体节、缺乏心跳3个致
          物浓度，每组设3个复孔。预先收集肿瘤干细胞肿瘤球                            死条件中任何1个发生为胚胎死亡标准；以斑马鱼胚胎
          并接种至 24 孔板中，第 2 天分别用 ATRA（10 μmol/L）、               体节发育异常、心包水肿、躯干水肿等情况为畸形标准。
          小檗碱（10 μmol/L）处理肿瘤球，继续培养 3 d。使用光                    分别于药物处理前0 h及药物处理后24、48 h，使用体视
          学显微镜在药物处理0、48、72 h时拍摄并记录肿瘤球形                        显微镜记录胚胎存活数和畸形数，计算48 h时的胚胎存
          态变化。                                                活率和畸形率。胚胎存活率（%）＝胚胎存活数/胚胎总
          2.3 小檗碱对肿瘤干细胞焦亡的影响                                  数×100%；胚胎畸形率（%）＝胚胎畸形数/胚胎存活
          2.3.1 肿瘤干细胞焦亡形态观察                                   数×100%。
              收集肿瘤干细胞并接种至24孔板中，根据前期预实                         2.5 统计学方法

          验和“2.2.1”项下 IC50结果，将细胞分为对照组（不含药                         采用GraphPad Prism 8.0 软件对实验数据进行统计
          物，含细胞、培养基）和小檗碱组（10、20、40 μmol/L），用                  学分析。满足正态分布的计量资料以x±s表示，多组间
          培养基或小檗碱处理24 h后，在光学显微镜下观察肿瘤                          比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用 LSD-t
          干细胞的焦亡形态，并拍照记录。                                     检验。检验水准α＝0.05。
          2.3.2 肿瘤干细胞LDH释放检测                                  3 结果
              参照“2.3.1”项下方法进行分组和给药，每组设 3 个
                                                              3.1 肿瘤干细胞获得结果
          复孔，同时设 6 个对照孔（不含药物，含细胞、培养基）。
                                                              3.1.1 肿瘤干细胞分选和培养结果
          处理23 h后，取3个对照孔，分别加入200 μL LDH释放
                                                                  由图1可知，在普通培养瓶中培养的B16F10细胞呈
          剂作为细胞最大酶活性孔，继续作用 1 h 后收集细胞上
                                                              纺锤形和上皮样细胞的混合群体，在超低吸附培养瓶中
          清液，于4 ℃以1 500 r/min离心5 min；取120 μL上清液
                                                              培养的肿瘤干细胞形成肿瘤球。
          至 96 孔板中，每孔加入 60 μL 新鲜配制的 LDH 检测工
          作液，室温孵育 30 min，立即用酶标仪检测各孔在 490
          nm 波长处的 OD 值，并计算 LDH 释放率。LDH 释放率
         （%）＝（给药孔 OD－对照孔 OD）/（最大酶活性孔 OD－
          对照孔OD）×100%。
          2.3.3 肿瘤干细胞焦亡相关蛋白表达检测
              采用 Western blot 法检测。参照“2.3.1”项下方法进                     A. B16F10细胞             B. 肿瘤干细胞
          行分组和给药。细胞培养 24 h 后，弃去培养基，用 PBS                            图1 B16F10细胞与肿瘤干细胞形态图
          清洗，以含磷酸酶抑制剂的 RIPA 裂解液于冰上裂解 30                       3.1.2 肿瘤干细胞表征结果
          min，于 4 ℃以 13 000 r/min 离心 15 min，收集上清液，采               由图 2 可知，与 B16F10 细胞比较，肿瘤干细胞中
                                                                  +
                                                                         +
          用 BCA 法检测后于 100 ℃变性处理，用十二烷基硫酸                       CD44 /CD133 细胞比例和 NANOG、OCT4 荧光强度均
          钠-PAGE分离；转膜，室温封闭5～10 min后加入相应一                      显著升高（P＜0.000 1），表明成功分选到B16F10来源的
          抗（GSDME、GSDME-N、caspase-3、cleaved-caspase-3、        肿瘤干细胞。
          GAPDH的稀释比例均为1∶1 000），在4 ℃下孵育过夜；                     3.2 小檗碱对肿瘤干细胞增殖的影响
          用TBST洗涤10 min×3次，加入辣根过氧化物酶标记的                       3.2.1 小檗碱对肿瘤干细胞活力的影响
          山羊抗兔 IgG 二抗（稀释度为 1∶1 000，稀释液为含                          CCK-8实验结果显示，在1.562 5～100 μmol/L浓度
          5%BSA 的 TBST 溶液），室温孵育 1.5 h 后，利用 ECL 发              范围内，ATRA和小檗碱均能抑制肿瘤干细胞增殖，且随
          光液显影，并在多功能成像仪下成像。以目的蛋白与内                            着药物浓度的增加，细胞存活率逐渐降低，呈剂量依赖
          参蛋白 GAPDH 的灰度值比值表示目的蛋白的表达                           趋势。结果见图 3。进一步计算 IC50 值，结果显示，
          水平。                                                 ATRA 的 IC50 为 130.5 μmol/L，小檗碱为 50.98 μmol/L。


          · 1446 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 12                            中国药房  2024年第35卷第12期
   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45