Page 39 - 《中国药房》2024年12期
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隆抗体（批号 L14NO11）购自成都正能生物技术有限责                       培养瓶）。在光学显微镜下观察并记录细胞形态。
          任公司；兔甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phos‐            2.1.2 肿瘤干细胞表征
          phate  dehydrogenase，GAPDH）抗 体 、磷 酸 盐 缓 冲 液            利用肿瘤干细胞特征蛋白CD44、CD133、NANOG、
         （PBS）、RIPA细胞快速裂解液、无蛋白快速封闭溶液、磷                       OCT4 对肿瘤干细胞进行表征。分别制备细胞数量为
          酸 化 蛋 白 酶 抑 制 剂（批 号 分 别 为 AC2111013A、              5×10 个/mL的B16F10细胞和肿瘤干细胞悬液，重悬至
                                                                  5
          GA2310014、CR2309010、CR2306034、CR2303107）均购         体积为 100 μL 后加入 FITC-CD44、PE-CD133，37 ℃避
                                                 TM
          自武汉赛维尔生物科技有限公司；Omni-Easy 速溶型                       光孵育30 min；用PBS洗涤，弃去上清液，随后在流式细
                                                                          +
                                                                                 +
          蛋白上样缓冲液（5×）、双色预染蛋白 Marker（15～250                   胞仪上对 CD44 /CD133 细胞比例进行分析。继续将两
          kDa）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electro‐         种细胞与Alexa Fluor 647标记的山羊抗兔IgG荧光二抗
                                                                               ®
          phoresis，PAGE）凝胶快速制备试剂盒（12.5%）（批号分                 进行孵育，在流式细胞仪上检测两种细胞中 NANOG、
                                                                                         +
                                                                                                +
          别为38116996、28231000、037B1900）均购自上海雅酶生              OCT4 的 荧 光 强 度 。 以 CD44 /CD133 细 胞 比 例 和
                                       ®
          物医药科技有限公司；Alexa Fluor 647 标记的山羊抗兔                  NANOG、OCT4 的荧光强度表示目的蛋白的表达情况，
          IgG荧光二抗（批号230719L01-01）购自上海百赛生物技                   若CD44、CD133、NANOG、OCT4高表达，表明成功分选
                                                                                      [10]
          术股份有限公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒、乳酸脱氢                         到B16F10来源的肿瘤干细胞 。
          酶（lactate dehydrogenase，LDH）细胞毒性检测试剂盒              2.2 小檗碱对肿瘤干细胞增殖的影响
         （批号分别为82123240311、11123230523）均购自上海碧                2.2.1 肿瘤干细胞活力检测
          云 天 生 物 技 术 股 份 有 限 公 司 ；PVDF 转 移 膜（批 号                实验分为空白组（只含培养基）、对照组（不含药物，
          0000286825）购自美国 Millipore 公司；辣根过氧化物酶               含细胞、培养基）、ATRA 组和小檗碱组。将肿瘤干细胞
                                                                    3
          标 记 的 山 羊 抗 兔 IgG 二 抗（批 号 RS0002）购 自 美 国           以 6×10 个/孔接种至 96 孔板中，然后将 ATRA 和小檗
          ImmunoWay 公司 ；超敏化学发光检测试剂盒（批号                       碱分别用培养基稀释成梯度浓度后加入相应培养孔中。
          220314E01-03）购自苏州优逸兰迪生物科技有限公司；                     根据本课题组前期实验结果及相关研究设定药物浓
                                                               [11]
          CCK-8 细胞增殖检测试剂盒（批号 23118704）购自北京                   度 ，ATRA 和小檗碱的给药浓度均为 1.562 5、3.125、
          兰杰柯科技有限公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡检测试                  6.25、12.5、25、50、100 μmol/L，每个浓度设3个复孔。分
          剂盒（批号A0217031）购自翌圣生物科技（上海）股份有                      别培养48 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，孵育2 h后，
          限公司。                                               用酶标仪在 450 nm 波长处检测其光密度（optical den‐
          1.3 细胞与实验动物                                        sity，OD）值，并计算细胞存活率。细胞存活率（%）＝（给
              小鼠皮肤黑色素瘤B16F10细胞购自美国典型培养                       药组 OD－空白组 OD）/（对照组 OD－空白组 OD）×
          物保藏中心。                                             100%。利用GraphPad Prism 8.0 软件计算两种药物的半
              野生型AB品系斑马鱼由成都中医药大学斑马鱼实                         数抑制浓度（IC50 ）。
          验平台提供，并根据标准方案培养。在室温 27.5～                          2.2.2 肿瘤干细胞凋亡率检测
          28.5 ℃、pH 7.2～7.6、光照14 h/黑夜10 h交替的环境下，                 实验分为对照组（不含药物，含细胞、培养基）、
          将性成熟斑马鱼以1∶1进行雌雄配对、交配、自然产卵，                         ATRA组（40 μmol/L）、小檗碱组（40 μmol/L），浓度根据
          供实验研究。                                            “2.2.1”项下结果设置，每组设 3 个复孔。将肿瘤干细胞
          2 方法                                               以 2×10 个/孔接种至 6 孔板中，置于 37 ℃恒温培养箱
                                                                    5
          2.1 肿瘤干细胞的获得                                       内培养过夜，然后与 ATRA、小檗碱分别共同孵育 24 h，
          2.1.1 肿瘤干细胞分选和培养                                   收集各组细胞，按照 Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡检测试剂
              利用肿瘤干细胞特征蛋白CD44和CD133进行细胞                      盒说明书操作，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
          分选。收集B16F10细胞，用CD44-FITC和CD133-PE染                 2.2.3 肿瘤干细胞分化程度检测
          色 30 min，随后使用流式细胞仪进行分选。未分选的                            参照“2.2.2”项下方法分组和给药，每组设3个复孔，
          B16F10 细胞在普通培养瓶中培养；分选得到的肿瘤干                        将肿瘤干细胞与 ATRA 和小檗碱分别共同孵育 48 h 后
          细胞在含有 B27 补充剂（1×）、人表皮生长因子（20                       收集各组细胞，加入CD44-FITC、CD133-PE、SOX2一抗
          ng/mL）、人碱性成纤维细胞生长因子（20 ng/mL）、重组                  （稀释度均为 1∶200），37 ℃孵育 30 min。针对 SOX2 一
                                                                                                     ®
          人胰岛素干粉（5 μg/mL）和青链霉素混合液（1×）的                       抗，孵育结束后，用PBS洗涤，加入Alexa Fluor 647标记
          DMEM/F12培养基中进行培养（所用培养瓶为超低吸附                        的山羊抗兔 IgG 荧光二抗（稀释度为 1∶400），避光孵育


          中国药房  2024年第35卷第12期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 12    · 1445 ·
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