Page 45 - 《中国药房》2024年10期
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量的1、2倍,剂量参考前期预实验结果设置;以5%羧甲 Prism 8.0软件作图。计量资料以x±s表示,多组间比较
基纤维素钠溶液为溶剂,灌胃体积为10 mL/kg),对照组 采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。
和模型组小鼠灌胃等体积 0.5% 羧甲基纤维素钠溶液, 检验水准α=0.05。
每天1次,连续8周。 3 结果
2.2 样本收集与小鼠体重、肝脏质量、肝脏指数检测 3.1 水蛭对NAFLD小鼠体重、肝脏质量及肝脏指数的
末次给药后,各组小鼠禁食12 h,于次日上午称重; 影响
腹腔注射 2% 戊巴比妥钠麻醉后摘除眼球取血,血样静 与对照组比较,模型组小鼠的体重、肝脏质量、肝脏
置 1 h 后,以 3 000 r/min 离心 15 min,分离上层血清,置 指数均显著升高(P<0.01);与模型组比较,水蛭低、高
于-20 ℃冰箱中保存,备用。随后,处死各组小鼠,迅速 剂量组小鼠的体重、肝脏质量、肝脏指数均显著降低
取出肝脏,以 4 ℃生理盐水清洗,并用滤纸吸除多余水 (P<0.01)。结果见表1。
分,称定肝脏质量,计算小鼠的肝脏指数[肝脏指数 表1 水蛭对 NAFLD 小鼠体重、肝脏质量及肝脏指数
(%)=小鼠肝脏质量(g)/小鼠体重(g)×100%]。称定肝 的影响(x±s,n=8)
脏质量后,取一部分肝组织于 10% 甲醛中固定,用于苏 组别 体重/g 肝脏质量/g 肝脏指数/%
木精-伊红(HE)染色和油红 O 染色实验;其余肝组织以 对照组 28.71±1.41 1.04±0.10 3.63±0.23
模型组 33.36±0.81 a 1.56±0.12 a 4.69±0.29 a
液氮速冻后,置于-80 ℃冰箱中保存,备用。
水蛭低剂量组 29.59±1.42 b 1.09±0.10 b 3.69±0.30 b
2.3 小鼠血清炎症相关因子及血脂水平检测 水蛭高剂量组 29.64±0.96 b 1.06±0.04 b 3.59±0.06 b
采用 ELISA 法检测。取“2.2”项下各组小鼠的血清 a:与对照组比较,P<0.01;b:与模型组比较,P<0.01。
样品,严格按照相应试剂盒说明书操作,使用酶标仪检 3.2 水蛭对 NAFLD 小鼠血清炎症相关因子及血脂水
测其炎症相关因子(NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α)和血脂 平的影响
指标(TC、TG、LDL-C、HDL-C)水平。 与对照组比较,模型组小鼠血清NF-κB、IL-1β、IL-6、
2.4 小鼠肝组织病理形态学观察 TNF-α和TG、TC、LDL-C水平均显著升高,HDL-C水平
取“2.2”项下经 10% 甲醛固定的各组小鼠肝组织适 显著降低(P<0.01);与模型组比较,水蛭低、高剂量组
量,一部分经脱水、石蜡包埋后切片,进行HE染色,使用 小鼠血清 NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α 和 TG、TC、LDL-C
显微镜观察其肝组织病理损伤情况;另一部分经OCT包 水平均显著降低,HDL-C 水平均显著升高(P<0.05 或
埋剂包埋后冷冻切片,进行油红 O 染色,使用显微镜观 P<0.01)。结果见表2。
察其肝组织脂质堆积情况。 3.3 水蛭对NAFLD小鼠肝组织病理形态学的影响
2.5 小鼠肝组织中PPARγ、SIRT1蛋白表达检测 HE 染色结果显示,对照组小鼠肝组织中肝细胞分
采用Western blot法检测。取“2.2”项下各组小鼠冻 布均匀,肝小叶结构正常,肝索排列规整;模型组小鼠肝
存的肝组织适量,加入 RIPA 裂解液,冷冻匀浆,于 4 ℃ 组织可见较多的脂肪空泡和炎症细胞浸润,肝索不清
以 12 000 r/min 离心 15 min,取上清液并采用 BCA 法测 晰,肝小叶结构模糊;水蛭低、高剂量组小鼠的病理改变
定蛋白浓度。蛋白经加热变性后,进行十二烷基硫酸 均有所缓解,脂肪空泡数量明显减少,但仍有少量炎症
钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,并以湿转法转至聚偏二 细胞浸润。油红O染色结果显示,模型组小鼠肝组织中
氟乙烯膜上,用 5% 脱脂奶粉封闭 2 h;加入 PPARγ、 的脂质堆积较对照组明显增加;而水蛭低、高剂量组小
SIRT1、GAPDH一抗(稀释比例分别为1∶1 000、1∶1 000、 鼠肝组织中的脂质堆积明显减少,水蛭高剂量组更接近
1∶10 000),于 4 ℃孵育过夜;以 TBST 洗膜 3 次,加入相 于对照组。结果见图1。
应二抗(稀释比例为 1∶20 000),于室温孵育 1 h;以 3.4 水蛭对NAFLD小鼠肝组织中PPARγ、SIRT1蛋白
TBST洗膜3次,用特超敏ECL化学发光试剂盒显色、曝 表达的影响
光。以GAPDH为内参,使用Image J软件分析目的蛋白 与对照组比较,模型组小鼠肝组织中PPARγ、SIRT1
的表达水平(目的蛋白的表达水平=目的蛋白的条带灰 蛋白的表达水平均显著降低(P<0.01);与模型组比较,
度值/内参蛋白的条带灰度值)。 水蛭低、高剂量组小鼠肝组织中 PPARγ、SIRT1 蛋白的
2.6 统计学方法 表 达 水 平 均 显 著 升 高(P<0.05 或 P<0.01)。 结 果
采 用 SPSS 26.00 软 件 进 行 统 计 分 析 ,GraphPad 见图2。
表2 水蛭对NAFLD小鼠血清炎症相关因子及血脂水平的影响(x±s,n=8)
组别 NF-κB/(pg/mL) IL-1β/(pg/mL) IL-6/(pg/mL) TNF-α/(pg/mL) TC/(mmol/L) TG/(mmol/L) LDL-C/(mmol/L) HDL-C/(mmol/L)
对照组 872.21±51.15 97.56±6.04 96.67±4.35 490.59±47.12 3.68±0.47 0.78±0.24 1.19±0.37 2.07±0.28
模型组 1 091.65±48.90 a 117.82±6.63 a 114.62±5.75 a 588.23±33.10 a 27.50±1.07 a 2.32±0.25 a 21.73±1.76 a 0.44±0.15 a
水蛭低剂量组 965.17±41.55 b 104.35±3.85 b 104.79±4.17 b 520.23±22.17 b 20.42±1.67 b 1.91±0.16 c 17.29±1.40 b 1.63±0.25 b
水蛭高剂量组 909.21±39.44 b 97.36±6.10 b 98.05±3.63 b 506.42±35.83 b 16.62±1.32 b 1.28±0.33 b 13.14±1.09 b 1.90±0.18 b
a:与对照组比较,P<0.01;b:与模型组比较,P<0.01;c:与模型组比较,P<0.05。
中国药房 2024年第35卷第10期 China Pharmacy 2024 Vol. 35 No. 10 · 1195 ·