Page 32 - 《中国药房》2024年10期

再经超声（功率150 W，频率 20 kHz）处理至澄清；将上 2.2.8 裸鼠肿瘤组织中HK2、PKM2蛋白表达的检测
述匀浆液以 4 000 r/min 离心 15 min，取上清液，参照相 采用免疫组织化学法检测。取各组裸鼠肿瘤组织
应试剂盒说明书方法操作，以酶标仪检测其肿瘤组织中 适量，用 4% 多聚甲醛溶液固定 24 h、流水冲洗 12 h 后，
TNF-α、IL-6水平。 行常规脱水、透明、切片、烤片、脱蜡、水化、热修复及封
2.2.6 裸 鼠 肿 瘤 组 织 中 MRP1、P-gp、GLUT1、LDHA 闭，加入 HK2、PKM2 一抗（稀释比例均为 1∶100），于
mRNA表达检测 4 ℃孵育过夜；洗膜 3 次后，加入相应二抗（稀释比例
为 1∶200），再经DAB显色、苏木精复染、乙醇脱水、二甲
采用实时PCR（real-time PCR，RT-PCR）法检测。取
苯透明、中性树胶封片后，使用显微镜观察，采用Image J
各组裸鼠肿瘤组织适量，提取总 RNA，测定浓度及纯度
软件对阳性染色区域（呈棕色或棕黄色）的平均光密度
后，将其逆转录为 cDNA。以所得 cDNA 为模板，进行
进行分析，以表示目的蛋白的表达水平。
PCR 扩 增 。 PCR 反 应 体 系（20 μL）包 括 cDNA 模 板
2.3 统计学方法
1 μL，2×SuperReal PreMix Plus 试剂 10 μL，10 μmol/L
采用 SPSS 25.0 软件对数据进行统计分析，采用
的上、下游引物各0.6 μL，无酶ddH2O 7.8 μL。PCR条件
GraphPad Prism 8.0软件作图。计量资料以x±s表示，多
为 95 ℃预变性 10 min；94 ℃变性 10 s，58 ℃退火 30 s，
组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较用
72 ℃延伸 30 s，共 40 个循环。采用 2 －ΔΔCt 法检测各目的
LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
基因mRNA的表达水平，结果以对照组为参照进行归一
3 结果
化处理。PCR引物序列及产物长度见表1。
3.1 细胞实验结果
表1 PCR引物序列及产物长度
在 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μg/mL 顺铂的干预下，
基因名称 引物序列（5′→3′） 产物长度/bp 耐药细胞 MKN45/DDP 的存活率均显著高于亲本细胞
MRP1 正向：GTCGGGGCATATTCCTGGC 117
反向：CTGAAGACTGAACTCCCTTCCT MKN45（P＜0.05）；MKN45/DDP 和 MKN45 细胞的 IC50
P-gp 正向：GGGATGGTCAGTGTTGATGGA 110 分别为（1.052 0±0.221 9）、（0.372 1±0.238 0）μg/mL，
反向：GCTATCGTGGTGGCAAACAATA 耐药指数为2.827。结果见图1。
GLUT1 正向：GGCCAAGAGTGTGCTAAAGAA 201
反向：ACAGCGTTGATGCCAGACAG 100 a MKN45细胞
LDHA 正向：TTGACCTACGTGGCTTGGAAG 91 a MKN45/DDP细胞
80 a
反向：GGTAACGGAATCGGGCTGAAT a
β-actin 正向：CATGTACGTTGCTATCCAGGC 250 60 a
反向：CTCCTTAATGTCACGCACGAT 细胞存活率/% 40
2.2.7 裸鼠肿瘤组织中相关蛋白表达的检测
20 a
采用 Western blot 法检测。取各组裸鼠肿瘤组织适
0
量，加入裂解液（全程冰上操作），于 4 ℃以 12 000 r/min
0.1 0.2 0.4 0.8 1.6 3.2
离心 10 min，取上清液，测定浓度后，将其与 5×还原型 顺铂/（μg/mL）
a：与MKN45细胞比较，P＜0.05。
蛋白上样缓冲液（体积比 4∶1）充分混匀，随后于沸水浴
图1 人胃癌 MKN45 亲本细胞与 MKN45/DDP 耐药细
中变性10 min。取变性蛋白适量，进行10%十二烷基硫 胞的存活率比较（x±s，n＝6）
酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转至聚偏二氟乙烯膜
3.2 动物实验结果
上，以快速封闭液孵育15 min；洗膜后，加入通路相关蛋
3.2.1 复方蜥蜴散对胃癌裸鼠体重、肿瘤体积及肿瘤生
白（PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt）、耐药相关蛋白（MRP1、
长的影响
P-gp）、糖酵解相关蛋白（GLUT1、LDHA）、内参（β-actin）
裸鼠体重曲线（图 2A）显示，各药物组裸鼠各时间
一抗（稀释比例分别为1∶500、1∶500、1∶500、1∶500、1∶1 000、
点的体重与模型组比较，差异均无统计学意义（P＞
1∶1 000、1∶500、1∶500、1∶3 000），于4 ℃孵育过夜；洗膜
0.05）。肿瘤生长曲线（图2B）显示，顺铂组、复方蜥蜴散
后，加入相应二抗（稀释比例为1∶5 000），于室温下孵育 组裸鼠第 28 天时的肿瘤体积和联合组裸鼠第 24、28 天
2 h；加入ECL化学发光液显影后，置于超灵敏多功能成 的肿瘤体积均显著小于模型组，且复方蜥蜴散组裸鼠第
像仪下成像，用Image J软件分析蛋白条带的灰度值，以 28 天的肿瘤体积和联合组裸鼠第 24、28 天的肿瘤体积
目的蛋白与内参蛋白（β-actin）的条带灰度值比值作为目 均显著小于顺铂组（P＜0.05）。肿瘤生长抑制率检测结
的蛋白的相对表达量，以p-PI3K与PI3K、p-Akt与Akt蛋 果（图2C）显示，各药物组裸鼠的肿瘤生长抑制率均显著
白的相对表达量比值表示 PI3K、Akt 蛋白的磷酸化 高于模型组，且复方蜥蜴散组和联合组裸鼠的肿瘤生长
水平。 抑制率均显著高于顺铂组（P＜0.05）。

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