Page 31 - 《中国药房》2024年10期
P. 31
疫 吸 附 测 定（ELISA）检 测 试 剂 盒（批 号 GEM0001、 培养 48 h，加入 CCK-8 试剂适量，于 37 ℃孵育 2 h，使用
GEM0004）及兔源P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）单克隆 酶标仪在490 nm波长处检测各孔的吸光度（A）值，并计
抗体（批号GB113291）均购自武汉赛维尔生物科技有限 算 细 胞 存 活 率 [ 细 胞 存 活 率（%）＝（A 药物组 －A 空白组）/
公司；兔源 PI3K、磷酸化 PI3K（phosphorylated PI3K， （A 对照组－A 空白组 ）×100%]。以细胞存活率为纵坐标、顺铂
p-PI3K）、Akt、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）、乳 质量浓度为横坐标，采用 Graphpad Prism 8 软件确定半
酸脱氢酶 A（lactate dehydrogenase A，LDHA）、葡萄糖转 数抑制浓度（IC50 ），并计算耐药细胞的耐药指数（耐药指
运 蛋 白 1（glucose transporter-1，GLUT1）、己 糖 激 酶 2 数为MKN45/DDP细胞与MKN45细胞的IC50比值）。
（hexokinase-2，HK2）、丙酮酸激酶 M2（pyruvate kinase 2.2 动物实验
M2，PKM2）、β-肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体和辣根过 2.2.1 复方蜥蜴散水煎液的制备
氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔 IgG 二抗（批号分别为 采用传统煎煮方法，按组方比例称取复方蜥蜴散
AF6241、AF3241、AF6261、AF0016、AF6280、AF5462、 组方药材，用水定容至 1 000 mL，浸泡 40 min 后煮沸；
AF6176、AF5234、AF7018、S0001）均购自美国 Affinity 待温度降至 80 ℃，继续煎煮至 500 mL，用纱布过滤；药
Biosciences 公司；兔源多药耐药相关蛋白 1（multidrug 渣加水800 mL，同法第2次煎煮；合并2次煎煮药液，根
resistance-associated protein 1，MRP1）多克隆抗体（批号 据前期预实验结果，按照《伤寒论》的去渣再煎之法，将
GTX116046）购自美国GeneTex公司。 上述煎煮药液浓缩成质量浓度为 0.28 g/mL（以生药量
1.3 实验细胞与动物 计）的水煎液，于4 ℃保存，备用。
人胃癌细胞MKN45（货号CTCC-ZHYC-0503）和人 2.2.2 胃癌耐药裸鼠移植瘤模型的建立
[5]
胃癌耐药细胞MKN45/DDP（货号CTCC-0520-NY）均购 参考文献方法 建立胃癌耐药裸鼠移植瘤模型：于
自浙江美森细胞科技有限公司。 无菌条件下取 1×10 个/mL 的 MKN45/DDP 细胞悬液
7
SPF 级 BALB/c 裸鼠 32 只，雄性，体重（20±2）g，购 [以磷酸盐缓冲液（PBS）为溶剂]0.2 mL，皮下接种至
自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产 BALB/c裸鼠的右前腋窝，若接种1周后可扪及明显肿块
许可证号为 SCXK（京）2021-0006。所有裸鼠均饲养于 则表明胃癌耐药裸鼠移植瘤模型复制成功。
宁夏医科大学实验动物中心[24 h 光照/黑暗循环，温度 2.2.3 分组与给药
（22±3）℃、相对湿度（50±10）%]，自由摄食、饮水，适应 将造模成功的裸鼠随机分为模型组、顺铂组、复方
性喂养1周后开始实验。本研究方案经宁夏医科大学实 蜥蜴散组、联合组，每组8只（由第三方对裸鼠进行随机
验动物中心实验动物福利伦理审查委员会批准，批准号 编号，以防止选择性偏倚）。复方蜥蜴散组裸鼠灌胃复
为IACUC-NYLAC-2023-018。 方蜥蜴散水煎液（2.8 g/kg，剂量参照相关文献 [6―7] ），每天
2 方法 2次；顺铂组裸鼠腹腔注射顺铂（0.002 g/kg，以生理盐水
[5]
2.1 细胞实验 为溶剂，剂量参照相关文献 ），每周2次；联合组裸鼠灌
2.1.1 细胞培养 胃复方蜥蜴散水煎液（2.8 g/kg），每天 2 次，同时腹腔注
将 MKN45 细胞接种于 RPMI 1640 完全培养基（含 射顺铂（0.002 g/kg），每周 2 次；模型组裸鼠灌胃等体积
10%FBS、1% 青-链霉素双抗的 RPMI 1640 培养基，下 生理盐水。各组均连续干预4周。
同）中培养；将MKN45/DDP细胞接种于含0.1 μg/mL顺 2.2.4 裸鼠肿瘤体积及肿瘤生长抑制率的检测
铂的RPMI 1640完全培养基中培养以维持耐药性，于正 自给药起，每4 d测量各组裸鼠的体重，计算肿瘤体
2
[8]
式实验前2周接种于不含顺铂的RPMI 1640完全培养基 积[肿瘤体积（V）＝a×b /2（式中，a为长径，b为短径）] ，
中培养。培养条件均为 37 ℃、5%CO2。待细胞生长至 并绘制裸鼠体重和肿瘤体积生长曲线。末次给药 24 h
对数生长期进行实验。 后，各组裸鼠以1%戊巴比妥钠（4 mg/kg）腹腔注射麻醉
2.1.2 2种细胞的增殖能力及耐药指数检测 后处死，完整剥离肿瘤组织，同法计算其体积，并计算肿
采用 CCK-8 法检测。取对数生长期的 MKN45 和 瘤生长抑制率[肿瘤生长抑制率（%）＝（裸鼠处死后模型
4
MKN45/DDP细胞，以1×10 个/mL接种于96孔板中，培 组肿瘤体积－裸鼠处死后药物组肿瘤体积）/裸鼠处死后
[8]
养 24 h 后，分别加入不同质量浓度的顺铂[即不同质量 模型组肿瘤体积×100%] 。
浓度顺铂组（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μg/mL的顺铂），质 2.2.5 裸鼠肿瘤组织中TNF-α、IL-6水平检测
[5]
量浓度设置参照相关文献 ]，同时设置对照组（加细胞， 采用 ELISA 法检测。取“2.2.4”项下各组裸鼠的肿
不加药）和空白组（无细胞，不加药），每组设置6个复孔。 瘤组织，剪碎。取该组织适量，加入10倍量的PBS匀浆，
中国药房 2024年第35卷第10期 China Pharmacy 2024 Vol. 35 No. 10 · 1181 ·
