Page 84 - 《中国药房》2024年9期

根据前期预实验及单因素考察结果，确定制备 ZIF-8 的粒径、Zeta 电位和多分散系数。采用透射电镜在 80
NPs的溶剂为甲醇，溶液混合时以液下注入的方式加入， kV 分析 TMZ@ZIF-8 NPs 的结构特征。采用 FTIR 仪检
离心速率为 12 000 r/min，利用正交试验，构建以 ZIF-8 测ZIF-8 NPs、TMZ、TMZ@ZIF-8 NPs的官能团。
NPs粒径大小为指标，以六水硝酸锌浓度、2-甲基咪唑浓 2.5 体外抗肿瘤活性实验
度、六水硝酸锌与2-甲基咪唑物质的量比和搅拌时间为 2.5.1 细胞培养
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因素的因素水平表与L9（3）设计表，用以筛选制备ZIF- 大鼠脑胶质瘤 C6 细胞培养于 DMEM 培养基中，在
8 NPs的最优处方工艺。 5% CO2、37 ℃细胞培养箱中持续培养。待细胞生长至
表1 单因素试验水平与因素参数 对数生长期，将C6细胞接种至细胞培养板上，轻轻摇动
六水硝酸锌浓度/ 2-甲基咪唑浓度/ 六水硝酸锌与2-甲基 溶液混合时 搅拌时间/ 离心速率/ 培养板，然后移至培养箱中。
水平
（mmol/mL） （mmol/mL） 咪唑物质的量比 的加入方式 min （r/min） 2.5.2 细胞毒性检测
1 0.025 0.20 1∶2 液下注入 30 10 000
2 0.050 0.40 1∶4 缓慢滴入 45 12 000 采用 CCK-8 法检测。取“2.5.1”项下对数生长期的
3 0.100 0.80 1∶8 快速倒入 60 14 000 C6 细胞，按 5×10 个/孔接种于 96 孔板，DMEM 高糖培
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2.2 TMZ@ZIF-8 NPs的制备 养基培养过夜。去除培养液，将细胞分为对照组和不同
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通过浸渍法完成 TMZ 的负载 。将未负载药物的 浓度的处理组，对照组加入 200 μL 的 DMEM 高糖培养
ZIF-8 NPs溶液加入到含有TMZ的甲醇溶液中，TMZ与 基，处理组分别加入含不同浓度（5、10、20、50、100、200、
ZIF-8 NPs物质的量比为1∶3。混合后的溶液搅拌12 h， 400、800 μg/mL）TMZ、ZIF-8 NPs、TMZ@ZIF-8 NPs 的
离心收集产物，用甲醇和超纯水多次洗涤。最后，将产 新鲜DMEM高糖培养基，孵育24、48、72 h后，去除旧细
物分散到超纯水中，经冷冻干燥后，得到浅粉色粉末状 胞培养液。每孔加入CCK-8试剂10 μL，37 ℃细胞培养
的TMZ@ZIF-8 NPs。 箱中再孵育4 h后，在酶标仪上检测450 nm波长处的吸
采用酸解法检测 TMZ@ZIF-8 NPs 的载药率（drug- 光度，计算相对细胞存活率。相对细胞存活率（%）＝处
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loading efficiency，LE） 。 将 TMZ@ZIF-8 NPs 冻 干 粉 理组吸光度/对照组吸光度×100%。
2.0 mg 与 0.1 mol/L 的 HCl 溶液 1 mL 混合，超声破坏 5 2.5.3 细胞摄取检测
min，然后用超纯水清洗。采用紫外-可见分光光度法在 （1）使用 Rho 代替 TMZ 加载到 ZIF-8 NPs 递送系统
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329 nm 波长处检测从 NPs 中释放的药物浓度 ，计算 中形成 Rho@ZIF-8 NPs。取“2.5.1”项下对数生长期的
TMZ@ZIF-8 NPs 中 TMZ 的 LE（W e/Wm×100%）。式中， C6细胞，按1×10 个/孔接种至玻璃底培养皿中，DMEM
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W e为包封于 TMZ@ZIF-8 NPs 内的药量，Wm为药物递送 高糖培养基培养过夜。去除培养液，然后用 Hoechst 染
系统的总质量。 料对细胞核进行染色，避光孵育5 min，用PBS洗涤2次。
2.3 体外溶出实验 细胞膜用Dio染料染色，避光孵育10 min，用PBS洗涤2
采用动态膜透析法研究TMZ@ZIF-8 NPs的释放行 次。最后，分别加入游离 Rho 和 Rho@ZIF-8 NP（Rho 含
为。由于 TMZ 在 pH＞7 的介质中会迅速分解，故在模 量相同）。在0.5、2、4 h时，采用高分辨率活细胞成像系
拟人体正常生理环境的介质中[磷酸盐缓冲液（PBS）， 统获得细胞荧光强度图像。
pH7.4]，TMZ很难被定量检测，故采用pH5.0的PBS模拟 （2）采用流式细胞术获得游离 Rho 和 Rho@ZIF-8
肿瘤区域微环境。将 1 mL TMZ@ZIF-8 NPs 悬浮液转 NPs的摄取量。取“2.5.1”项下对数生长期的C6细胞，以
移至透析袋中（分子量截至 3 000 Da），放入含有 10 mL 2×10 个/孔接种至 12 孔板中，每孔体积 1 mL，DMEM
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PBS（pH5.0）的 EP 管中，并转移至恒温振荡器（37 ℃， 高糖培养基培养过夜。弃去旧的培养液，分别加入游离
110 r/min）模拟体内条件的 TMZ 释放。然后，在指定的 Rho和Rho@ZIF-8 NPs（Rho含量相同）。孵育不同时间
时间点（1、2、4、8、12、24、36、48、72 h）取出 1.0 mL 释放 （0.5、2、4 h）后，PBS 洗涤 2 次，用胰酶进行消化，最后得
介质，并将 1.0 mL 新鲜介质加回释放介质中。参考 到的单细胞悬液分别收集到不同的离心管中，以 2 000
“2.2”项下紫外-可见分光光度法检测释放出的药物浓 r/min 离心 3 min 后，去除上清液，沉淀细胞团用 PBS 重
度，计算药物累积溶出速率（cumulative dissolution rate， 悬并转移至流式管中，使用流式细胞仪测定其荧光强
CDR），绘制累积释放百分比曲线。CDR（%）＝[Cn ·V2/ 度，通过荧光强度定量对比观察细胞摄取情况。
L+（Cn－1+……+C2+C1 ）·V1/L）]×100%。式中，Cn为各时 2.5.4 细胞凋亡检测
间点取出后的样品浓度，L为制剂标示量，V1为各时间点 采用流式细胞术检测。取“2.5.1”项下对数生长期
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固定取样体积，V2为溶出介质体积。 的C6细胞，按2×10 个/孔接种至12孔板，每组设4个复
2.4 材料的表征 孔，DMEM 高糖培养基培养过夜。去除培养液，参考
采用激光粒度仪分析 TMZ@ZIF-8 NPs、ZIF-8 NPs “2.5.2”项下CCK-8法分组情况及其检测结果，分别加入

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