Page 39 - 《中国药房》2024年8期

注射20 mg/mL戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，于大鼠右 比 例 为 1∶3 000），室 温 孵 育 45 min；以 TBST 洗 膜 5
后足跖皮内注射CⅡ乳剂0.1 mL，并于其尾根部多点皮 min×6次，采用ECL发光剂显影成像，并以Image J图像
内注射 CⅡ乳剂 0.4 mL，以完成初次免疫；第 7 天，同法 分析系统对蛋白条带灰度值进行分析，以TLR4与β-actin
进行二次免疫（二次免疫1周后，若大鼠后爪红肿，近端 的灰度值比值表示TLR4蛋白的表达水平，以p-JAK2与
趾间关节出现梭形趾，表明造模成功）。正常对照组大 JAK2、p-STAT3 与 STAT3 的 灰 度 值 比 值 表 示 JAK2、
鼠则仅注射等体积无菌蒸馏水。自第14天起，除正常对 STAT3蛋白的磷酸化水平，结果以正常对照组为参照进
照组外，其余各组大鼠以高脂饮食喂养；高脂饮食喂养 行归一化处理。
的同时，各药物组大鼠灌胃相应药液（以0.5%羧甲基纤 2.7 统计学方法
维素钠溶液为溶剂），正常对照组和模型组大鼠灌胃等 采用 SPSS 16.0 软件进行统计分析，采用 GraphPad
体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每天1次，连续36 d。 8.0.2软件绘图。数据以x±s表示，多组间比较采用单因
2.3 大鼠全身评分、关节炎指数以及足爪肿胀数检测 素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验。检验水准
参考文献方法 ，在实验第 14、28、49 天对除正常对 α＝0.05。
[2]
照组（实验过程中无RA症状）外的其余各组大鼠进行全 3 结果
身评分、关节炎指数以及足爪肿胀数检测。全身评分标 3.1 大鼠全身评分、关节炎指数和足爪肿胀数
准如下：耳朵、鼻、尾、足、爪有几处出现结节或肿胀，则 在第28天时，阿司匹林组大鼠的足爪肿胀数较模型
记为几分。关节炎指数评分标准如下：0分表示无红肿； 组显著降低（P＜0.05），野蔷薇根总黄酮高剂量组大鼠
1 分表示趾关节稍肿；2 分表示趾关节和足跖肿胀；3 分 的全身评分、关节炎指数和足爪肿胀数均较模型组显著
表示踝关节以下的足爪肿胀；4 分表示包括踝关节在内 降低（P＜0.05）；在第 28、49 天时，野蔷薇根总黄酮低剂
的全部足爪肿胀。足爪肿胀数评分标准：踝关节和趾关 量组大鼠的全身评分（第28天时除外）、关节炎指数和足
节有几处出现肿胀，则记为几分。 爪肿胀数均较模型组显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01）。
2.4 大鼠血清中IL-6、ICAM-1、VCAM-1水平检测 结果见表1。
末次给药 1 h 后，麻醉大鼠，于腹主动脉取血，将血 3.2 大鼠血清中炎症因子水平
样静置 2 h 后，以 3 580×g 离心 10 min，分离血清，采用 与 正 常 对 照 组 比 较 ，模 型 组 大 鼠 血 清 中 IL-6、
ELISA 法以酶标仪测定各组大鼠血清中 IL-6、ICAM-1、 ICAM-1、VCAM-1水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组
VCAM-1水平。 比较，阿司匹林组和野蔷薇根总黄酮各剂量组大鼠血清
2.5 大鼠胸主动脉血管组织病理学形态观察 中上述指标水平均显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01）。结
取血完成后，解剖大鼠，取其胸主动脉，一部分置于 果见表2。
4%多聚甲醛中固定，另一部分置于－80 ℃冰箱中保存。 3.3 大鼠胸主动脉血管组织病理学形态
将于4%多聚甲醛中固定的胸主动脉组织取出，经脱水、 正常对照组大鼠胸主动脉血管弹性膜排列整齐且
透明、浸蜡、包埋、切片后，进行苏木精-伊红（HE）染色， 层次清晰，内膜较为光滑，中膜无增厚现象；与正常对照
然后使用显微镜观察血管组织病理变化并拍照记录。 组比较，模型组大鼠胸主动脉血管形成动脉粥样斑块
2.6 大鼠胸主动脉血管组织中TLR4、JAK2、STAT3等 （粥瘤），可见胆固醇结晶、淋巴细胞浸润及少量未破裂
蛋白表达检测 的泡沫细胞聚集；各给药组大鼠胸主动脉血管组织的病
采用 Western blot 法检测。随机选择取每组 3 只大 理损伤均较模型组明显减轻。结果见图1。
鼠的胸主动脉组织约 100 mg，以 RIPA 裂解液裂解、匀 3.4 大鼠胸主动脉血管组织中TLR4、JAK2、STAT3等
浆，离心后收集上清液。采用 BCA 法测定总蛋白含量 蛋白表达情况
后将蛋白变性；取变性蛋白适量，进行十二烷基硫酸钠- 与正常对照组比较，模型组大鼠血管组织中 TLR4
聚丙烯酰胺凝胶电泳（200 V，35 min）分离，并以湿转法 蛋白表达水平和 JAK2、STAT3 蛋白磷酸化水平均显著
（400 mA，20 min）转至聚偏二氟乙烯膜上，加入5%牛血 升高（P＜0.01）。与模型组比较，阿司匹林组大鼠血管
清 白 蛋 白 封 闭 液 ，室 温 封 闭 1 h；加 入 TLR4、JAK2、 组织中 TLR4 蛋白表达水平和 JAK2 蛋白磷酸化水平均
STAT3、p-JAK2、p-STAT3、β-actin一抗（稀释比例分别为 显著降低，而 STAT3 蛋白磷酸化水平显著升高（P＜
1∶1 000、1∶750、1∶750、1∶1 500、1∶5 000、1∶1 500），室温 0.01）；野蔷薇根总黄酮各剂量组大鼠血管组织中上述指
孵育1 h；以TBST洗膜5 min×4次，加入相应二抗（稀释 标水平均显著降低（P＜0.01）。结果见图2、表3。
表1 各组大鼠全身评分、关节炎指数和足爪肿胀数的检测结果（x±s，n＝10）
全身评分/分 关节炎指数/分 足爪肿胀数/分
组别
第14天 第28天 第49天 第14天 第28天 第49天 第14天 第28天 第49天
模型组 2.25±0.46 2.00±0.00 1.13±0.35 4.25±0.71 4.00±1.07 2.13±0.99 6.13±0.35 6.38±0.74 3.75±2.19
阿司匹林组 2.25±0.46 1.88±0.35 0.75±0.46 4.63±0.74 3.50±1.20 1.38±0.74 6.25±0.46 5.63±1.92 a 2.13±1.64
野蔷薇根总黄酮高剂量组 2.25±0.46 1.50±0.53 a 0.75±0.46 4.25±0.46 2.75±1.16 a 1.50±0.53 6.13±0.64 4.63±1.77 a 3.25±2.38
野蔷薇根总黄酮低剂量组 2.50±0.53 1.88±0.35 0.50±0.53 a 4.50±0.76 2.25±1.04 b 0.38±0.52 b 6.25±0.71 2.00±1.60 b 0.25±0.46 b
a：与模型组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.01。

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