Page 39 - 《中国药房》2024年8期
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注射20 mg/mL戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后,于大鼠右                  比 例 为 1∶3  000),室 温 孵 育 45  min;以 TBST 洗 膜 5
          后足跖皮内注射CⅡ乳剂0.1 mL,并于其尾根部多点皮                        min×6次,采用ECL发光剂显影成像,并以Image J图像
          内注射 CⅡ乳剂 0.4 mL,以完成初次免疫;第 7 天,同法                   分析系统对蛋白条带灰度值进行分析,以TLR4与β-actin
          进行二次免疫(二次免疫1周后,若大鼠后爪红肿,近端                          的灰度值比值表示TLR4蛋白的表达水平,以p-JAK2与
          趾间关节出现梭形趾,表明造模成功)。正常对照组大                           JAK2、p-STAT3 与 STAT3 的 灰 度 值 比 值 表 示 JAK2、
          鼠则仅注射等体积无菌蒸馏水。自第14天起,除正常对                          STAT3蛋白的磷酸化水平,结果以正常对照组为参照进
          照组外,其余各组大鼠以高脂饮食喂养;高脂饮食喂养                           行归一化处理。
          的同时,各药物组大鼠灌胃相应药液(以0.5%羧甲基纤                         2.7 统计学方法
          维素钠溶液为溶剂),正常对照组和模型组大鼠灌胃等                               采用 SPSS 16.0 软件进行统计分析,采用 GraphPad
          体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液,每天1次,连续36 d。                       8.0.2软件绘图。数据以x±s表示,多组间比较采用单因
          2.3 大鼠全身评分、关节炎指数以及足爪肿胀数检测                          素方差分析,组间两两比较采用 LSD-t 检验。检验水准
              参考文献方法 ,在实验第 14、28、49 天对除正常对                   α=0.05。
                          [2]
          照组(实验过程中无RA症状)外的其余各组大鼠进行全                          3 结果
          身评分、关节炎指数以及足爪肿胀数检测。全身评分标                           3.1 大鼠全身评分、关节炎指数和足爪肿胀数
          准如下:耳朵、鼻、尾、足、爪有几处出现结节或肿胀,则                             在第28天时,阿司匹林组大鼠的足爪肿胀数较模型
          记为几分。关节炎指数评分标准如下:0分表示无红肿;                          组显著降低(P<0.05),野蔷薇根总黄酮高剂量组大鼠
          1 分表示趾关节稍肿;2 分表示趾关节和足跖肿胀;3 分                       的全身评分、关节炎指数和足爪肿胀数均较模型组显著
          表示踝关节以下的足爪肿胀;4 分表示包括踝关节在内                          降低(P<0.05);在第 28、49 天时,野蔷薇根总黄酮低剂
          的全部足爪肿胀。足爪肿胀数评分标准:踝关节和趾关                           量组大鼠的全身评分(第28天时除外)、关节炎指数和足
          节有几处出现肿胀,则记为几分。                                    爪肿胀数均较模型组显著降低(P<0.05 或 P<0.01)。
          2.4 大鼠血清中IL-6、ICAM-1、VCAM-1水平检测                    结果见表1。
              末次给药 1 h 后,麻醉大鼠,于腹主动脉取血,将血                     3.2 大鼠血清中炎症因子水平
          样静置 2 h 后,以 3 580×g 离心 10 min,分离血清,采用                  与 正 常 对 照 组 比 较 ,模 型 组 大 鼠 血 清 中 IL-6、
          ELISA 法以酶标仪测定各组大鼠血清中 IL-6、ICAM-1、                  ICAM-1、VCAM-1水平均显著升高(P<0.01);与模型组
          VCAM-1水平。                                          比较,阿司匹林组和野蔷薇根总黄酮各剂量组大鼠血清
          2.5 大鼠胸主动脉血管组织病理学形态观察                              中上述指标水平均显著降低(P<0.05 或 P<0.01)。结
              取血完成后,解剖大鼠,取其胸主动脉,一部分置于                        果见表2。
          4%多聚甲醛中固定,另一部分置于-80 ℃冰箱中保存。                        3.3 大鼠胸主动脉血管组织病理学形态
          将于4%多聚甲醛中固定的胸主动脉组织取出,经脱水、                              正常对照组大鼠胸主动脉血管弹性膜排列整齐且
          透明、浸蜡、包埋、切片后,进行苏木精-伊红(HE)染色,                       层次清晰,内膜较为光滑,中膜无增厚现象;与正常对照
          然后使用显微镜观察血管组织病理变化并拍照记录。                            组比较,模型组大鼠胸主动脉血管形成动脉粥样斑块
          2.6 大鼠胸主动脉血管组织中TLR4、JAK2、STAT3等                   (粥瘤),可见胆固醇结晶、淋巴细胞浸润及少量未破裂
          蛋白表达检测                                             的泡沫细胞聚集;各给药组大鼠胸主动脉血管组织的病
              采用 Western blot 法检测。随机选择取每组 3 只大               理损伤均较模型组明显减轻。结果见图1。
          鼠的胸主动脉组织约 100 mg,以 RIPA 裂解液裂解、匀                    3.4 大鼠胸主动脉血管组织中TLR4、JAK2、STAT3等
          浆,离心后收集上清液。采用 BCA 法测定总蛋白含量                         蛋白表达情况
          后将蛋白变性;取变性蛋白适量,进行十二烷基硫酸钠-                              与正常对照组比较,模型组大鼠血管组织中 TLR4
          聚丙烯酰胺凝胶电泳(200 V,35 min)分离,并以湿转法                    蛋白表达水平和 JAK2、STAT3 蛋白磷酸化水平均显著
         (400 mA,20 min)转至聚偏二氟乙烯膜上,加入5%牛血                    升高(P<0.01)。与模型组比较,阿司匹林组大鼠血管
          清 白 蛋 白 封 闭 液 ,室 温 封 闭 1  h;加 入 TLR4、JAK2、         组织中 TLR4 蛋白表达水平和 JAK2 蛋白磷酸化水平均
          STAT3、p-JAK2、p-STAT3、β-actin一抗(稀释比例分别为             显著降低,而 STAT3 蛋白磷酸化水平显著升高(P<
          1∶1 000、1∶750、1∶750、1∶1 500、1∶5 000、1∶1 500),室温    0.01);野蔷薇根总黄酮各剂量组大鼠血管组织中上述指
          孵育1 h;以TBST洗膜5 min×4次,加入相应二抗(稀释                    标水平均显著降低(P<0.01)。结果见图2、表3。
                          表1 各组大鼠全身评分、关节炎指数和足爪肿胀数的检测结果(x±s,n=10)
                                  全身评分/分                      关节炎指数/分                      足爪肿胀数/分
          组别
                         第14天      第28天     第49天      第14天      第28天     第49天      第14天      第28天     第49天
          模型组           2.25±0.46  2.00±0.00  1.13±0.35  4.25±0.71  4.00±1.07  2.13±0.99  6.13±0.35  6.38±0.74  3.75±2.19
          阿司匹林组         2.25±0.46  1.88±0.35  0.75±0.46  4.63±0.74  3.50±1.20  1.38±0.74  6.25±0.46  5.63±1.92 a  2.13±1.64
          野蔷薇根总黄酮高剂量组   2.25±0.46  1.50±0.53 a  0.75±0.46  4.25±0.46  2.75±1.16 a  1.50±0.53  6.13±0.64  4.63±1.77 a  3.25±2.38
          野蔷薇根总黄酮低剂量组   2.50±0.53  1.88±0.35  0.50±0.53 a  4.50±0.76  2.25±1.04 b  0.38±0.52 b  6.25±0.71  2.00±1.60 b  0.25±0.46 b
             a:与模型组比较,P<0.05;b:与模型组比较,P<0.01。


          中国药房  2024年第35卷第8期                                                 China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 8    · 933 ·
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