Page 20 - 《中国药房》2024年8期
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2.2 gracillin干预浓度和作用时间筛选 结果设置），每组设置3个复孔，培养24 h。收集细胞，以
取对数生长期的 A549 细胞，按 3 000 个/孔接种于 Trizol法提取总RNA，经超微量紫外分光光度计定量后，
96 孔板中，培养 24 h 后，将其分为 gracillin 不同浓度组 按相应试剂盒说明书方法将其反转录成 cDNA，以所得
（0.25、0.5、1、2、4 μmol/L，浓度参考相关文献 设置）和 cDNA 为 模 板 进 行 PCR 扩 增 。 反 应 体 系 包 括 1 μg
[3]
正常对照组（不加药物），并设置不加药物、不加细胞的 cDNA、1 μL随机引物、1 μL逆转录酶、10 μL 2×反应混
空白组，每组设置 3 个复孔。各组细胞分别于 37 ℃、 合液，加无核酶水至 20 μL。反应条件为 95 ℃预变性 5
5%CO2 条件下培养 12、24、48 h 后，弃去培养液，加入 min；95 ℃变性 5 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 40
CCK-8 溶液 10 μL 和 F12K 完全培养基 100 μL，继续培 个循环。以 FAM102A 与内参（GAPDH）的扩增量比值
养2 h。使用连续光谱多功能酶标仪于450 nm波长处检 表示 FAM102A mRNA 的表达水平，结果以对照组为参
测各孔的光密度（optical density，OD）值并计算细胞存活 照进行归一化处理。FAM102A 的正向引物为 5′-TCA-
率[细胞存活率＝（实验组平均 OD 值－空白组平均 OD GGCGGAAGAAGGACTC-3′，反 向 引 物 为 5′-GTGT-
值）/（正常对照组平均 OD 值－空白组平均 OD 值）× TGCTGCCATCTGTGAAC-3′，产 物 大 小 为 121 bp；
100%]。以gracillin浓度为横坐标、细胞存活率为纵坐标 GAPDH 的正向引物为 5′-ACGGATTTGGTCGTATTG-
绘制细胞生长曲线，应用两点法计算半数抑制浓度（half GG-3′，反向引物为 5′-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-
maximal inhibitory concentration，IC50 ）。 3′，产物大小为171 bp。
2.3 gracillin对A549细胞自噬小体形成的影响 2.6 gracillin对A549细胞中FAM102A蛋白、自噬相关
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取对数生长期的 A549 细胞，按 8×10 个/皿接种于 蛋白以及PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响
10 cm培养皿中，将其分为对照组（不加药物）和gracillin 采用Western blot法检测。取对数生长期的A549细
组（2 μmol/L，浓度参考“2.2”项实验结果设置），培养 24 胞，按“2.5”项下方法分组、给药、培养。收集细胞，加入
h。收集细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液清洗 1～2 次后转 含 1% 苯甲基磺酰氟和 1% 磷酸酶抑制剂的 RIPA 裂解
移至 1.5 mL EP 管中，以 1 000 r/min 离心 5 min，弃去上 液，离心获取总蛋白；以 BCA 法检测总蛋白浓度后，按
清液，细胞于2%戊二醛1 mL中静置过夜，经固定、制片 比例加入上样缓冲液，于沸水中加热10 min变性。取变
后，使用生物透射电子显微镜观察自噬小体生成情况并 性蛋白样品适量，电泳分离后转膜，用5%牛血清白蛋白
采集图像。 于室温下封闭 1 h；加入 FAM102A 蛋白、自噬相关蛋白
2.4 gracillin 对 A549 细胞自噬小体膜上 GFP-LC3 聚 （p62、Beclin-1、LC3B）、PI3K/Akt 通路相关蛋白（PI3K、
集的影响 p-PI3K、Akt、p-Akt）、内参蛋白（GAPDH）一抗（稀释比例
取对数生长期的 A549 细胞，按 2×10 个/皿接种于 均为 1∶1 000），于 4 ℃下孵育过夜；用 TBST 缓冲液洗
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激光共聚焦小皿上，待细胞生长融合至 80% 时，进行质 膜，加入相应二抗（稀释比例均为1∶2 000），于室温下孵
粒转染。转染时，先用Opti-MEM无血清培养基稀释Li‐ 育1 h；用TBST缓冲液洗膜，滴加ECL曝光液，于室温下
pofectamine 2000 转染试剂和 GFP-LC3 质粒，随后将该 放置 1 min 后，置于化学发光成像系统下曝光显影。采
转染复合物加至细胞中，转染 6～8 h 后更换新的 F12K 用 Image J 软件分析各蛋白的条带灰度值，以目的蛋白
完全培养基，置于培养箱中培养过夜。将上述细胞分为 与内参蛋白的条带灰度值比值表示目的蛋白的表达水
对照组（不加药物）和gracillin不同浓度组（0.25、0.5、1、2 平（结果以对照组为参照进行归一化处理），以p-PI3K与
μmol/L，浓度参考“2.2”项实验结果设置），培养24 h。收 PI3K、p-Akt 与 Akt 的表达水平比值表示 PI3K、Akt 蛋白
集细胞，用 4% 多聚甲醛固定，加入 4′，6-二脒基-2-苯基 的磷酸化水平。
吲哚（DAPI）染液，于室温避光条件下染色 10 min，用磷 2.7 统计学方法
酸盐缓冲液洗涤后置于激光共聚焦显微镜下观察GFP- 使用 GraphPad Prism 8.0 软件对数据进行统计分
LC3在自噬小体膜上的聚集情况。 析。数据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分
2.5 gracillin 对 A549 细胞中 FAM102A mRNA 表达的 析，进一步两两组间比较采用 LSD-t 检验。检验水准
影响 α＝0.05。
采用实时定量PCR法检测。取对数生长期的A549 3 结果
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细胞，按 2×10 个/孔接种于 6 孔板中，待细胞生长融合 3.1 gracillin干预浓度和作用时间筛选结果
超过 70% 时，将其分为对照组（不加药物）和 gracillin 不 gracillin对A549细胞具有增殖抑制作用，且呈浓度
同浓度组（0.25、0.5、1、2 μmol/L，浓度参考“2.2”项实验 和时间依赖性趋势（图1）。由于12 h作用时间太短，48 h
· 914 · China Pharmacy 2024 Vol. 35 No. 8 中国药房 2024年第35卷第8期
