Page 25 - 《中国药房》2024年8期
P. 25

乳腺癌是全球常见的恶性肿瘤，死亡率较高，是女                         别为RB-VY-074、RB-VY-107）均购自广州锐博生物科技
                              [1]
          性的主要健康问题之一 。目前，乳腺癌的发病率仍在                           有限公司；5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（5-ethynyl-2′-deoxy‐
                                           [2]
          不断上升，且理想治疗药物仍需探索 。桃叶珊瑚苷                            uridine，EdU）细胞增殖试剂盒（批号 RCF043）购自上海
         （aucubin，Auc）是从包括杜仲叶在内的多种药用植物中                      茹创生物科技有限公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI 细胞凋亡
          提取的一种低毒性天然化合物，具有抗氧化、抗炎、抗肿                          试剂盒（批号 SB-F6012）购自上海圣尔生物科技有限公
                      [3]
          瘤等生物活性 。研究表明，Auc 能减轻乳腺癌引起的                         司 ；兔 上 皮 钙 黏 素（E-cadherin）、神 经 钙 黏 素（N-
          器官炎症性损伤，可诱导小鼠乳腺癌细胞4T1的凋亡 ，                         cadherin）、纤维连接蛋白（fibronectin，FN）、B 细胞淋巴
                                                       [4]
          但具体作用机制尚不清楚。                                       瘤 2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相关 X 蛋白（Bcl-
              周 期 蛋 白 依 赖 性 激 酶（cyclin-dependent  kinase，    2 associated X protein，Bax）、CDK1、CCNB1、PLK1、甘油
          CDK）属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，其中 CDK1 能调节                      醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体和辣根过氧化物酶
          细胞周期，促进细胞增殖。研究指出，CDK1在乳腺癌细                        （HRP）标记的山羊抗兔 IgG 二抗（批号分别为 A22333、
          胞中呈过度表达，其表达水平与患者进展后的总体生存                           A19083、 A12977、 A0208、 A0207、 A0220、 A2056、
                                [5]
          率和无复发生存率有关 。周期蛋白 B1（cyclin B1，                     A21082、AC001、AS029）均购自武汉爱博泰克生物科技
          CCNB1）是一种重要的细胞周期调节蛋白，其异常表达                         有限公司。
          对细胞周期具有重要影响。研究指出，CCNB1 在乳腺                         1.3 细胞
          癌细胞中呈高度表达，相关药物可通过靶向 CCNB1 来                            人乳腺癌细胞 MCF-7（批号 bio-73090）购自北京百
                          [6]
          抑制乳腺癌的进展 。Polo 样激酶 1（Polo-like kinase 1，           欧博伟生物技术有限公司。
          PLK1）是一种在乳腺癌细胞中过表达的蛋白激酶，抑制                         1.4 动物
          PLK1可诱导细胞阻滞于G2/M期，并抑制乳腺癌细胞增                            SPF 级雌性 BALB/c 裸鼠，体重 18～20 g，购自济南
          殖 。可见，CDK1/CCNB1/PLK1 信号通路与细胞周期                    朋悦实验动物繁育有限公司，动物生产许可证号为
            [7]
          密切相关，抑制此通路可有效抑制乳腺癌的进展，但Auc                         SCXK（鲁）2022 0006。所有裸鼠均饲养于 26～27 ℃、
          能否通过该信号通路影响乳腺癌细胞的恶性生物学行                            每12 h光照/黑暗交替的环境下，自由摄食、饮水。本实
          为尚不清楚。此外有研究指出，上皮-间充质转化                             验方案经商丘医学高等专科学校实验动物伦理委员会
         （epithelial-mesenchymal transition，EMT）与肿瘤细胞的       批准（批号202205192106047）。
          侵袭和迁移密切相关，是乳腺癌发生发展的重要环节，                           2 方法
                                                       [8]
          抑制EMT进程可有效抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移 。                          2.1 细胞实验
          基于此，本研究拟从 CDK1/CCNB1/PLK1 信号通路出                    2.1.1 细胞培养及Auc干预浓度、时间筛选
          发，初步探讨 Auc 对乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移等恶                            将乳腺癌细胞 MCF-7 置于含谷氨酰胺（300 mg/L）
          性生物学行为的影响及潜在机制，以期为乳腺癌的治疗                           的RPMI 1640完全培养基（即含5%灭活的胎牛血清、10
          提供参考。                                              mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、1 mmol/L 丙酮酸
          1 材料                                               钠和 1% 青-链霉素双抗的 RPMI 1640 培养基）中培养
          1.1 主要仪器                                          （37 ℃，5%CO2 ）。取对数生长期细胞，按5×10 个/孔接
                                                                                                     3
              本研究所用主要仪器包括 CS-160L 型细胞培养箱                     种到 96 孔板中，以不同浓度 Auc[0（对照）、10、20、40、
                                                                                         [9]
         （上海目尼实验设备有限公司）、SpectraMax iD5 型酶标                   80、160 μmol/L，浓度按相关文献 设置，以Tris缓冲液为
          仪（美国 Molecular Devices 公司）、BX53 型荧光显微镜             溶剂，下同]干预24、48、72 h，同时设置不含药物、不含细
         （日本 Olympus 公司）、MI40 型倒置生物显微镜（广州市                   胞的空白组，每组设置6个复孔。随后，每孔加入CCK-8
          明美光电技术有限公司）、FACSCalibur 型流式细胞仪                     试剂适量，于37 ℃下培养1.5 h后，使用酶标仪于450 nm
         （美国BD Bioscience公司）、GelDoc Go型凝胶成像系统                波长处检测各孔的光密度（OD）值，并按下式计算细胞
         （美国Bio-Rad公司）等。                                     活力：细胞活力（%）＝（OD 药物组－OD 空白组）/（OD 对照组－
          1.2 主要药品与试剂                                        OD 空白组）×100%。据此结果确定后续实验 Auc 的干预
              Auc对照品（批号A31971，纯度≥98%）购自上海吉                   浓度及时间。
          至生化科技有限公司；胰蛋白酶、RPMI 1640培养基、结                      2.1.2 细胞分组及处理
          晶紫染色液、RIPA 裂解液（批号分别为 T1300、31800、                      将细胞分为对照组、Auc 低浓度组（Auc-L 组）、Auc
          G1062、R0010）均购自北京索莱宝科技有限公司；1 mol/L                 中浓度组（Auc-M组）、Auc高浓度组（Auc-H组）、Auc高
          的Tris缓冲液（批号T301502）购自上海阿拉丁生化科技                     浓度+过表达CDK1阴性对照组（Auc-H+pcDNA-NC组）
          股份有限公司；CCK-8试剂盒（批号HB-CCK-8-1000）购                  和 Auc 高浓度+过表达 CDK1 组（Auc-H+pcDNA-CDK1
          自汉恒生物科技（上海）有限公司；Lipofectamine  2000                组），每组设置 6 个复孔。参考“2.1.1”项下结果，Auc-L
                                                   TM
          转染试剂盒（批号 11668019）购自美国 Thermo Fisher               组、Auc-M 组、Auc-H 组分别用 20、40、80 μmol/L 的 Auc
          Scientific 公司；pcDNA-NC、pcDNA-CDK1 质粒（批号分           处 理 48  h；Auc-H+pcDNA-NC 组 和 Auc-H+pcDNA-


          中国药房  2024年第35卷第8期                                                 China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 8    · 919 ·
   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30