Page 19 - 《中国药房》2024年8期

dependent manner. The IC50 was 2.55 μmol/L at 24 h. After 24 h of gracillin treatment， autophagosomes with bilayer membrane
structure were found in the cell cytoplasm， and GFP-LC3 green fluorescent spots on autophagosome membrane were obvious，
representing an increasing trend as drug concentration. Compared with the control group， mRNA and protein expressions of
FAM102A （0.5， 1， 2 μmol/L groups）， protein expression of Beclin-1 （1， 2 μmol/L groups） and LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ ratio （2 μmol/L
group） were significantly increased in different concentrations of gracillin groups， while the protein expression of p62 （1， 2 μmol/L
groups）， and the protein phosphorylations of Akt （1， 2 μmol/L groups） and PI3K （2 μmol/L group） were all decreased
significantly （P＜0.05 or P＜0.01）. CONCLUSIONS Gracillin can promote excessive autophagy in A549 cells by up-regulating
mRNA and protein expressions of FAM102A and inhibiting PI3K/Akt signaling pathway， thus inhibiting cell proliferation.
KEYWORDS Reineckia carnea； gracillin； non-small cell lung cancer cells； autophagy； FAM102A； PI3K/Akt signaling pathway

吉 祥 草 为 百 合 科 植 物 吉 祥 草 Reineckia carnea 司）等。
（Andr.）Kunth 的干燥全草，具有润肺、止咳、镇痛等功 1.2 主要药品与试剂
[1]
效 。研究指出，吉祥草主要含甾体皂苷、黄酮等化学成 gracillin由本课题组前期从吉祥草R. carnea（Andr.）
[2]
[3]
分，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等药理活性 。本课题组 Kunth的干燥全草中提取分离得到 ，经高效液相色谱法
前期从吉祥草提取物中分离得到一个甾体皂苷类化合 检测纯度大于98%。
物——纤细薯蓣皂苷（gracillin），对肺癌细胞具有较好 F12K培养基、胎牛血清、0.25%胰酶溶液（批号分别
的增殖抑制作用 [3―4] ；此外有研究者发现，gracillin对人肝 为 2444952、2556132P、25200-056）均购自美国 Gibco 公
癌 H7402、HepG2 细胞等多种肿瘤细胞具有细胞毒活 司；兔抗人序列相似性家族 102 成员 A（family with se‐
[5]
性 。可见，该成分极具开发潜力。目前，gracillin 国内 quence similarity 102 member A，FAM102A）抗 体 、Opti-
外相关研究主要集中在细胞毒活性和促进细胞凋亡、调 MEM无血清培养基、Lipofectamine 2000转染试剂（批号
[6]
节能量代谢方面 ，而其对肺癌的作用机制尚不明确。 分 别 为 PA5-70892、31985062、11668030）均 购 自 美 国
本课题组前期通过高通量转录组测序、基因本体 Thermo Fisher Scientific公司；兔抗人p62、Beclin-1、微管
（gene ontology，GO）富集、京都基因和基因组数据库 相 关 蛋 白 1 轻 链 3B（microtubule-associated protein 1
（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通 light chain 3B，LC3B）、PI3K、磷酸化 PI3K（phosphory‐
路富集分析发现，对比对照组，FAM102A基因在gracillin lated PI3K，p-PI3K）、Akt、磷 酸 化 Akt（phosphorylated

组 A549 细胞中的表达显著升高，且富集于自噬相关通 Akt，p-Akt）抗体（批号分别为 5114-6、3738S-3、2775S-
路 。 FAM102A 是 雌 激 素 α 受 体（estrogen receptor α， 13、4249T-11、4428T-5、9272S、9271T）均购自美国 Cell
ERα）的靶基因，而 ERα 是磷脂酰肌醇 3 激酶（phos‐ Signaling Technology 公 司 ；CCK-8 试 剂 盒（ 批 号
phoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase GK10001）购自美国 GlpBio 公司；鼠抗人甘油醛-3-磷酸
[7]
B，又名Akt）信号通路的磷酸化靶点 ，在调控细胞自噬 脱氢酶（GAPDH）抗体（批号 C1312）购自北京普利莱基
方面具有重要作用 。基于此，本研究拟从FAM102A基 因技术有限公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠、羊抗
[8]
因和 PI3K/Akt 信号通路出发，考察 gracillin 对人非小细 兔 免 疫 球 蛋 白 G 抗 体（批 号 分 别 为 RGAM001、
胞肺癌 A549 细胞增殖和自噬的影响及潜在机制，旨在 RGAR001）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；GFP-
为gracillin抗肿瘤作用的深入研究提供参考。 LC3质粒购自武汉淼灵生物科技有限公司。
1 材料 1.3 细胞
1.1 主要仪器 人非小细胞肺癌细胞株A549（批号SCSP-503）购自
本研究所用主要仪器包括Varioskan Flash型连续光 中国科学院上海生科院细胞资源中心。

谱多功能酶标仪、NanoDrop One型超微量紫外分光光度 2 方法
计、331 型细胞培养箱（美国 Thermo Fisher Scientific 公 2.1 细胞培养
TM
司），CFX Connect 型荧光定量聚合酶链式反应（PCR） 取 A549 细胞，接种于 F12K 完全培养基（即含 10%
仪、Chemi Doc XRS+型化学发光成像系统（美国 Bio- 胎牛血清和 1% 青-链霉素双抗的 F12K 培养基，下同）
Rad公司），HT7800型生物透射电子显微镜（日本Hitachi 中，在 37 ℃、5%CO2条件下培养，并依据细胞生长状态
公司），LSM880 型激光共聚焦显微镜（德国 Zeiss 公 及时更换培养基。

中国药房 2024年第35卷第8期 China Pharmacy 2024 Vol. 35 No. 8 · 913 ·