Page 55 - 《中国药房》2024年7期
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2.3 饮食量、饮水量和粪便含水率测定                                析目标条带的灰度值。目标蛋白的表达水平＝目标蛋
              实验期间记录各组大鼠每天（24 h）的摄食量和饮水                      白条带灰度值/内参（β-actin）蛋白条带灰度值。
          量。分别于造模前及造模7、14、20ｄ和给药7、14ｄ这6                      2.9 统计学方法
          个时间点，在灌胃药液中加入2%的墨汁，给药后将大鼠                              采用SPSS 21.0软件进行数据处理与分析。实验结
          装入代谢笼内，下垫白色滤纸，观察 6 h，记录大鼠首次                        果均以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组
          排黑粪时间。收集各组大鼠6 h粪便，称其湿重，烘干后                         间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
          称粪便干重，每周测定1次。计算粪便含水率：粪便含水                          3 结果
          率（%）＝（粪便湿重－粪便干重）/粪便湿重×100%。                        3.1 一般情况观察结果
          2.4 唾液流率测定                                             正常组大鼠在实验过程中精神状态好，皮毛茂密光
              每 10 d 测定各组大鼠唾液流率 1 次（即分别在造模                   泽，动作敏捷，反应迅速，大便呈颗粒状、软硬适中且无
          10、20 d 时及给药 9 d 后测定），并记录。将已称好干重                   特殊颜色与臭味。与正常组比较，模型组大鼠精神倦
          的棉球放入实验用动物口颊内，3 min后取出，立即用电                        怠，行动迟缓，活动减少，毛发干枯竖立、无光泽感，大便
          子天平称棉球的湿重，并计算唾液分泌量和唾液流率。                           质地偏软或不成形、具恶臭味。阳性对照组及HMF中、
          唾液分泌量（mg）＝棉球湿重（mg）－棉球干重（mg）。                       高剂量组大鼠一般情况较模型组均有不同程度的改善。
          唾液流率（mg/min）＝唾液分泌量（mg）/3（min）。                         造模前，各给药组大鼠体重差异均无统计学意义
          2.5 动物取材与处理                                       （P＞0.05）。造模期间，除正常组外，其余各组大鼠的体
              末次给药后，禁食不禁水12 h，以3%戊巴比妥钠麻                      重均增长缓慢。造模后及给药 14 d 后，与正常组比较，
          醉大鼠，腹主动脉取血2 mL，装入含肝素钠的5 mL采血                       模型组大鼠体重显著减少（P＜0.01）。给药 14 d 后，与
          管中轻轻摇晃混匀，于4 ℃下以3 000 r/min离心10 min，                模型组比较，阳性对照组和HMF中、高剂量组大鼠体重
          分离血浆，冻存于－80 ℃冰箱待测。快速取出大鼠胃、                         均显著增加（P＜0.05或P＜0.01）。结果见图1。
          小肠组织，一部分置于－80 ℃冰箱中保存，另一部分置                               400                            正常组
                                                                                          b  b
          于4%多聚甲醛中固定，备用。                                                                    c     模型组
                                                                   300                  a         阳性对照组
          2.6 胃和小肠组织病理形态学观察                                                     a                 HMF低剂量组
              采用HE染色法进行观察。取“2.5”项下4%多聚甲                           体重/g                            HMF中剂量组
                                                                   200                            HMF高剂量组
          醛固定的大鼠胃、小肠组织，用水冲去表面残留的多聚
          甲醛，进行常规脱水、石蜡包埋、切片（厚度4～5 μm），HE                           100
                                                                         造模前              造模后             给药14 d
          染色后在光学显微镜下进行病理形态学观察并拍照。
                                                                a：与正常组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.01；c：与模型组
          2.7 血浆中醛固酮含量检测                                     比较，P＜0.05。
              采用 ELISA 法进行测定。取“2.5”项下冻存的大鼠                      图1 实验期间各组大鼠的体重变化（x±s，n＝7）
          血浆，按照 ELISA 试剂盒说明书步骤严格操作，测定血
                                                             3.2 饮食量、饮水量和粪便含水率测定结果
          浆中醛固酮含量。                                               给药14 d后，与正常组比较，模型组大鼠饮食量、饮
          2.8 胃组织中AQP3表达检测                                   水量显著减少（P＜0.01），粪便含水率显著增加（P＜
              采用Western blot法进行检测。取“2.5”项下冻存的                0.01）。与模型组比较，阳性对照组及 HMF 低、中、高剂
          大鼠胃组织，经磷酸盐缓冲液清洗后，加入 RIPA 裂解                        量组大鼠饮食量均显著增加、粪便含水率均显著减少
          液，于冰上裂解 30 min，在 4 ℃条件下以 12 000 r/min 离           （P＜0.05 或 P＜0.01），HMF 中、高剂量组大鼠饮水量均
          心10 min，收集上清。按BCA蛋白定量试剂盒说明书操                       显著增加（P＜0.01）。结果见表1。
          作，测定总蛋白浓度，并将蛋白变性。按 SDS-PAGE 凝                      表1 各组大鼠饮食量、饮水量、粪便含水率测定结果
          胶制备试剂盒说明书操作，制备10%的SDS-PAGE分离                            （x±s，n＝7）
          胶和 5% 的 SDS-PAGE 浓缩胶，待胶凝固后加入蛋白样                     组别             饮食量/g       饮水量/g      粪便含水率/%
          品，开始电泳；电泳结束后，在 300 mA 恒流下转膜                         正常组           17.79±1.02  32.11±1.21  13.25±0.53
                                                              模型组           10.16±0.27 a  25.71±0.66 a  16.70±0.58 a
         （PVDF膜）0.5 h，加脱脂牛奶室温封闭30 min；加入一抗                    阳性对照组         17.47±0.74 b  30.02±1.23 b  6.19±0.34 b
         （AQP3稀释比例为1∶1 000，β-actin稀释比例为1∶2 000），              HMF低剂量组       15.99±0.63 b  26.78±1.04  14.89±0.44 c
          4 ℃孵育摇床过夜；TBST 洗膜 3 次，加入二抗（二抗用                      HMF中剂量组       18.69±0.88 b  31.60±1.49 b  13.71±0.50 b
                                                              HMF高剂量组       17.01±0.67 b  29.08±1.11 b  12.16±0.55 b
          TBST按照1∶5 000的比例进行稀释），室温孵育30 min；
                                                                a：与正常组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.01；c：与模型组
          TBST 漂洗 3 次，ECL 显影，使用 Alpha 软件处理系统分                比较，P＜0.05。


          中国药房  2024年第35卷第7期                                                 China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 7    · 821 ·
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