Page 39 - 《中国药房》2024年6期
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1.3 实验动物                                           2.6 大鼠肝组织病理形态学观察
              SPF 级健康 SD 大鼠 60 只，雌雄各半，体重 180～                    取“2.2”项下各组大鼠固定好的肝组织，经脱水、透
          200 g，由郑州市惠济区华兴实验动物养殖场提供，动物                        明、包埋后，切片，进行常规苏木精-伊红（HE）染色，置于
          生产许可证号为 SCXK（豫）2019-0002。所有动物均饲                    显微镜下观察肝组织病理变化。同法制作切片，进行
          养于河南中医药大学医学机能实验室（室温20～22 ℃，                        Masson 染色，置于显微镜下观察肝组织纤维化情况，并
          相对湿度55%～60%，正常光照），自由饮水、采食。本实                       采用Image-Pro Plus 6.0软件检测Masson染色阳性（呈蓝
          验方案获河南中医药大学第一附属医院伦理委员会批                            色）面积百分比（即阳性面积与总面积的百分比值），用
          准（编号DWLL202201010）。                                以评价肝组织的纤维化水平。
          2 方法                                               2.7  大 鼠 肝 组 织 中 TGF- β1、Smad2、ERK1、Nrf2、
          2.1 分组、造模与给药                                       Keap1、HO-1蛋白表达水平检测
              将60只大鼠按随机数字表法分为正常对照组，模型                            采用免疫组化法检测。取“2.6”项下各组大鼠的肝
          组，灯盏花素低、中、高剂量组（5.4、10.8、21.6 mg/kg）和               组织切片，经脱蜡、水化、封闭（H2O2 ）、清洗、抗原修复
          秋水仙碱组（阳性对照，0.45 mg/kg），每组10只，雌雄各                  （柠檬酸盐缓冲液）后，滴加山羊血清封闭液，室温孵育；
          半。除正常对照组外，其余各组大鼠均按 1 mL/kg 腹腔                      弃去上清液，分别滴加 TGF-β1、Smad2、ERK1、Nrf2、
          注射50%CCl4-橄榄油溶液，每周2次，连续4周。若大鼠                      Keap1、HO-1 一抗（稀释比例均为 1∶1 000），4 ℃孵育过
          血清中 ALT、AST 水平显著升高，且肝组织可见明显纤                       夜；加入相应二抗（稀释比例为 1∶100），常温孵育 20～
          维化病变和炎症细胞浸润，则表明 HF 模型复制成                           30 min，以 DAB 显色；冲洗后，以苏木精复染，再以盐酸
          功 [1，13] 。造模后，灯盏花素低、中、高剂量组大鼠分别灌                    乙醇溶液分化；冲洗后，脱水、透明、封片，置于显微镜下
          胃相应混悬液[以 0.1%CMC-Na 溶液为溶剂；根据成人                     观察，并采用 Image-Pro Plus 6.0 软件检测阳性（呈棕黄
         （70 kg）剂量120 mg换算得大鼠中剂量10.8 mg/kg，再分                色）区域的积分光密度（integrated optical density，IOD）
          别以中剂量的 1/2、2 倍作为低、高剂量]，秋水仙碱组大                      值，用以评价目的蛋白的表达水平。
          鼠灌胃相应混悬液[以 0.1%CMC-Na 溶液为溶剂；根据                     2.8  大 鼠 肝 组 织 中 TGF- β1、Smad2、ERK1、Nrf2、
          成人（70 kg）剂量 5 mg 换算得大鼠剂量 0.45 mg/kg]，灌             Keap1、HO-1 mRNA表达水平检测
          胃体积均为 10 mL/kg；正常对照组、模型组大鼠灌胃等                          采用实时荧光定量PCR法检测。取“2.2”项下各组
          体积0.1%CMC-Na溶液；每天1次，连续28 d。                        大鼠冻存的肝组织适量，加入 TriQuick 试剂 1 mL，充分
          2.2 样本采集                                           研磨匀浆后提取总 RNA 并检测 RNA 浓度及纯度。按
              末次给药 24 h 后，称取各组大鼠体重，麻醉后于腹                     cDNA 合成试剂盒说明书方法操作，合成 cDNA；以此
          主动脉取血，血样于常温下静置1～2 h，低温离心，取上                        cDNA 为模板，进行 PCR 扩增。反应体系（共 15 μL）包
          层血清，于－80 ℃下储存，备用。取血后，脱颈椎处死各                        括 cDNA 模板 2 μL，上、下游引物共 1.5 μL，2×qPCR
          组大鼠并剖取肝脏，去除周围组织，以生理盐水洗涤，观                          Mix 7.5 μL，无核酸酶水 4 μL。扩增条件如下：95 ℃预
          察其外观形态，用滤纸吸尽其表面液体后称重；随后，将                          变性 10 min；95 ℃变性 15 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸
          肝脏一分为二，其中一份用4%多聚甲醛固定，另一份用                          30 s，共 40 个循环。反应结束后，根据扩增曲线及熔解
          液氮速冻后于－80 ℃下储存，备用。                                 曲线判断扩增结果，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）
          2.3 大鼠肝脏系数检测                                       为内参，采用2      －ΔΔCt 法计算目的基因的相对表达水平（结
              根据大鼠体重、肝脏质量，按下式计算各组大鼠的                         果以正常对照组为参照进行归一化处理）。PCR引物序
          肝脏系数：肝脏系数＝肝脏质量/体重。                                 列及扩增产物片段长度见表1。
          2.4 大鼠血清中ALT、AST水平检测                               2.9 统计学方法
              采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测。取“2.2”                        采用SPSS 24.0软件对数据进行统计分析。计量资
          项下各组大鼠血清样品适量，按照相应试剂盒说明书方                           料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间
          法操作，以酶标仪检测血清中ALT、AST水平。                            两两比较采用LSD-t检验（方差齐）或Dunnett检验（方差
          2.5 大鼠肝组织中 ALT、AST、SOD、MDA、GSH-Px 水                不齐）。检验水准α＝0.05。
          平检测                                                3 结果
              采用 ELISA 法检测。称取“2.2”项下各组大鼠冻存                   3.1 大鼠肝脏外观形态观察结果
          的肝组织适量，加入冰生理盐水 0.9 mL 制备 10% 匀浆                        正常对照组大鼠肝脏形态正常，外观红润；模型组
          液，以3 000 r/min离心10 min，取上清液适量，按照相应                 大鼠肝脏稍增大，颜色深，可见大面积白色结节灶；秋水
          试剂盒说明书方法操作，以酶标仪检测肝组织中 ALT、                         仙碱组和灯盏花素低、中、高剂量组大鼠肝脏颜色较模
          AST、SOD、MDA、GSH-Px水平。                              型组浅，白色结节灶面积有所缩小。结果见图1。


          中国药房  2024年第35卷第6期                                                 China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 6    · 673 ·
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