Page 25 - 《中国药房》2024年5期
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最后以 PyMOL 软件分析分子对接结果，以验证以上网 性染色，采用Image-Pro Plus 6.0软件测定每个视野中蓝
络药理学结果的可靠性。 绿色阳性面积与染色总面积，计算阳性面积百分比，以
2.2 实验验证 此评价心肌组织纤维化情况。
2.2.1 造模、分组与给药 2.2.7 大鼠心肌组织中ADA、ADK蛋白表达水平检测
大鼠适应性饲养1周后，按5 mg/kg皮下注射异丙肾 采用免疫组化法进行检测。取“2.2.6”项下制备的
上腺素进行造模，每天1次，连续14 d。造模完成后测定 组织切片，经二甲苯脱蜡、水化后，用柠檬酸盐缓冲液热
每只大鼠心电图，当大鼠心电图出现T波高耸及ST段呈 修复 8 min，待温度降至室温后，依次用 H2O2 孵育 10
[6]
弓背抬高，则表明 MF 大鼠模型造模成功 。将 50 只造 min、山羊血清孵育 30 min，然后滴加 ADA（稀释比例为
模成功的大鼠按体重随机分为模型组、卡托普利组（阳 1∶1 000）、ADK（稀释比例为 1∶300）抗体，4 ℃孵育过
性对照，9 mg/kg，为临床等效剂量）和熊果苷低、中、高剂 夜；次日切片于37 ℃复温30 min，滴加辣根过氧化物酶
量组（50、100、200 mg/kg，剂量根据文献[5]设置），每组 标记的羊抗兔二抗孵育 20 min，磷酸盐缓冲液浸洗，
10 只；另取 10 只未经造模的大鼠作为正常组。各给药 DAB 显色 10 min，自来水冲洗终止；切片再以苏木素复
组大鼠均灌胃给药（临用时用0.1% CMC-Na溶液将药物 染 3 min，盐酸乙醇分化，自来水再次冲洗蓝化，经乙醇
制成混悬液），灌胃体积均为10 mL/kg；正常组和模型组 梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片后镜检。每只大
大鼠灌胃等体积0.1% CMC-Na溶液；每天1次，连续28 d。 鼠心肌组织切片在 400 倍镜下随机选取 1 个视野，以棕
2.2.2 大鼠心电图检测 黄色为阳性染色，采用Image-Pro Plus 6.0软件测定每个
末次给药 24 h 后，各组大鼠先称重，然后腹腔注射 视野中积分光密度（integrated optical density，IOD）值，
1 g/kg 氨基甲酸乙酯进行麻醉，固定四肢，接入导联电 以IOD值表示目的蛋白表达水平。
极，采用 BL-420F 生物信号采集系统记录Ⅱ导联心电 2.2.8 大鼠心肌组织中ADA、ADK mRNA水平检测
图，观察大鼠心电图中ST段及T波变化。 取大鼠心肌组织 100 mg，加入 1 mL TriQuick 试剂
2.2.3 取材及处理 充分研磨匀浆后提取组织中总 RNA，检测总 RNA 浓度
待心电图检测完成后，将大鼠颈椎脱臼处死，解剖 及纯度，然后将其逆转录为cDNA，并以cDNA为模板进
取心脏，去除周围组织，以生理盐水洗涤后，观察心脏外 行PCR扩增。PCR扩增条件如下：95 ℃预变性10 min；
观形态。采用滤纸吸尽心脏表面液体后称重，然后去除 95 ℃变性 15 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 40 个
心房及右心室壁，留取左心室，称重。将左心室一分为 循环。以GAPDH基因为内参，采用2 －ΔΔCt 法计算目的基
二，其中一份用4%多聚甲醛固定，另一份用液氮速冻后 因的相对表达水平。PCR 引物序列由武汉塞维尔生物
于－80 ℃下储存。 科技有限公司合成，具体见表1。
2.2.4 大鼠心脏相关指数检测 表1 PCR引物序列及扩增产物长度
统计各组大鼠体重、心脏重量与左心室重量，计算 基因 引物序列（5′→3′） 扩增产物长度/bp
心脏质量指数（heart weight index，HWI）和左心室质量 ADA 上游：TCTCTCGCTCCCAGACTTCCT 116
下游：CTTCCTTTGCCTTCATCTCCAC
指数（left ventricle weight index，LVWI），以此来评价心
ADK 上游：AGAAATAGCCAGAAAGACGCAGG 198
脏病变程度。其中，HWI＝心脏质量（mg）/体重（g）， 下游：GACAGAAACCCTCCTACAAATGC
LVWI＝左心室质量（mg）/体重（g）。 GAPDH 上游：CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG 138
下游：GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT
2.2.5 大鼠心肌组织中心脏功能及纤维化指标水平检测
称取“2.2.3”项下冻存的心肌组织0.1 g，加入0.9 mL 2.2.9 统计学方法
冰生理盐水制备 10% 匀浆液，以 3 000 r/min 离心 10 数据采用SPSS 24.0软件进行统计分析。计量资料
min；取上清液，按照相应试剂盒说明书方法操作，采用 以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐
酶标仪测定大鼠心肌组织中 CK、LDH、NT-proBNP、 时组间两两比较采用 LSD-t 检验，方差不齐时组间两两
Col Ⅰ、Col Ⅲ水平。 比较采用Dennett’s检验。检验水准α＝0.05。
2.2.6 大鼠心肌组织病理形态学观察 3 结果
取“2.2.3”项下以 4% 多聚甲醛固定的心肌组织，经 3.1 网络药理学分析结果
乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后制作病理切片 3.1.1 熊果苷-MF靶点筛选和PPI网络构建结果
（厚度 4 μm）。切片经二甲苯脱蜡后，一部分进行苏木 经筛选得到熊果苷潜在靶点共14个，MF相关靶点
素-伊红（HE）染色，然后采用光学显微镜观察心肌组织 共4 409个，两者的交集靶点共8个。将8个交集靶点导
病理形态学变化。一部分切片进行 Masson 染色，其中 入 String 数据库后，获得熊果苷-MF 靶点 PPI 网络图（图
肌纤维呈红色，胶原纤维呈蓝绿色；每只大鼠心肌组织 1），该 PPI 网络图共包括 8 个节点和 4 条边，Degree 平均
切片在光学显微镜下随机选取1个视野，以蓝绿色为阳 值为1，平均局部聚集系数为0.625。
中国药房 2024年第35卷第5期 China Pharmacy 2024 Vol. 35 No. 5 · 531 ·
