Page 78 - 《中国药房》2024年3期
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2.2 动物分组、造模与给药                                      的羊抗兔IgG二抗（稀释比例为1∶2 000），室温孵育4 h；
              小鼠适应性喂养 3 d 后，按随机数字表法分为空白                       洗涤后暗室内采用ECL法检查，通过荧光化学发光凝胶
          组、模型组、阳性对照组（地西泮 2.6 mg/kg，为成人临床                     成像系统检测目的条带，采用 Image J 软件分析目的条
          等效剂量）和秫米提取物低、中、高剂量组（给药剂量分                           带灰度值。以目的蛋白条带与内参蛋白条带灰度值的
          别为1.2、2.4、4.8 g/kg；按照《中华本草》中记载的秫米临                  比值表示目的蛋白的表达水平，以 p-NF-κB p65 与 NF-
          床剂量并根据人和小鼠间体表面积折算的等效剂量为                             κB p65、p-PI3K与PI3K、p-Akt与Akt蛋白表达水平的比
          2.4 g/kg，以此作为中剂量），每组10只。除空白组外，其                     值分别表示NF-κB p65、PI3K、Akt蛋白的磷酸化水平。
          余各组小鼠均腹腔注射350 mg/kg PCPA混悬液，每天1                     2.7 统计学方法
          次，持续3 d，以建立失眠小鼠模型；造模结束后，观察小                             采用SPSS 24软件对数据进行统计分析。符合正态
          鼠行为，当小鼠出现活动次数增加、易激惹、昼夜节律缺                           分布的计量资料用x±s表示，多组间比较采用单因素方差
                                                    [10]
          失、白天与夜晚活动不间断等行为则为造模成功 。造                            分析，组间两两比较使用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
          模成功后，空白组和模型组小鼠灌胃等体积生理盐水，                            3 结果
          各给药组小鼠灌胃相应药物，灌胃体积为 0.01 mL/g，每                      3.1 秫米提取物对小鼠一般情况的影响
          天 1 次，连续 7 d。每天观察小鼠的精神活动状态、进食                           模型组小鼠白天活动增多，昼夜节律消失，精神亢
          量、饮水量、对外界刺激的反应及体重变化等一般情况。                           奋，易激惹，毛发竖起且无光泽，体形消瘦；各给药组小
          2.3 旷场行为学实验                                         鼠上述一般状态较模型组均明显改善。
              末次给药 60 min 后进行旷场行为学测试。将小鼠                      3.2 秫米提取物对小鼠旷场实验行为学表现的影响
          放置在反应箱正中央，采用小鼠的开场活动实验系统采                                与空白组比较，模型组小鼠的总静止时间、站立次
          集 5 min 内小鼠的总运动距离、总静止时间、总运动时                        数及修饰次数均显著延长/增加（P＜0.05），总运动距离、
          间、站立次数、修饰次数等活动轨迹。实验在安静、光线                           总运动时间均显著缩短（P＜0.05）；与模型组比较，阳性
          稳定的环境中进行。每只小鼠实验结束后，用75%乙醇
                                                              对照组和秫米提取物中、高剂量组小鼠的总运动时间均
          擦拭方箱内壁及底面，防止留下气味及排泄物等。
                                                              显著延长（P＜0.01），总静止时间均显著缩短（P＜0.01），
          2.4 标本采集与处理
                                                              并且秫米提取物各剂量组小鼠的站立次数及修饰次数
              旷场行为学实验之后，腹腔注射戊巴比妥钠（45                          均显著减少（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表1。
          mg/kg）麻醉小鼠，腹主动脉取血约1 mL，室温下静置1 h
                                                              表1 各组小鼠旷场实验行为学实验结果（x±s，n＝10）
          后以 4 000 r/min 离心 15 min，分离血清，－80 ℃保存备
                                                              组别         总运动距离/mm  总静止时间/s  总运动时间/s  站立次数  修饰次数
          用。小鼠取血后处死，剥离颅骨并分离海马，称取海马                            空白组       40 351.24±6 197.83  50.52±6.88  245.10±6.65  43.00±4.85 4.80±0.84
          质量，加入 9 倍体积预冷的磷酸盐缓冲液制备组织匀                           模型组       28 953.16±2 206.19 a  94.24±3.88 a  198.78±12.40 53.60±4.34 7.20±0.84 a
                                                                                                       a
                                                                                                a
                                                                                                b
          浆，并在4 ℃下以12 000 r/min离心15 min，取上清液于                 阳性对照组     35 827.18±2 494.41  73.56±7.42 b  238.46±13.14 49.80±3.27 5.60±0.89
                                                                                                       c
                                                              秫米提取物低剂量组 29 372.82±1 346.61  85.48±9.23  214.52±15.74 38.00±4.74 4.80±1.30 c
          －80 ℃保存备用。                                          秫米提取物中剂量组 34 533.60±2 166.02  75.00±6.29 b  232.82±9.61 b  37.60±3.21 4.60±0.55 b
                                                                                                       b
          2.5 小鼠血清和海马组织中单胺类神经递质和炎症指                           秫米提取物高剂量组 35 607.24±4 662.43  74.02±6.83 b  238.06±9.19 b  34.40±6.11 4.20±1.30 b
                                                                                                      b
          标测定                                                    a：与空白组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.01；c：与模型组
              取“2.4”项下血清，采用ELISA法测定血清中5-HT、                   比较，P＜0.05。
          BDNF、IL-2、IL-6、Bcl-2、Bax 的含量以及海马组织中 5-              3.3 秫米提取物对小鼠血清中单胺类神经递质和炎症
          HT、5-HTAA 的含量，并计算 Bcl-2/Bax 比值。严格按照                 指标的影响
          相应试剂盒说明书操作。                                             与空白组比较，模型组小鼠血清中 5-HT、BDNF、
          2.6 小鼠海马组织中 PI3K/Akt/NF-κB 信号通路相关                   Bcl-2 含量和 Bcl-2/Bax 比值均显著降低（P＜0.05），IL-
          蛋白表达检测                                              6、IL-2 和 Bax 含量均显著升高（P＜0.05）；与模型组比
              采用 Western blot 法进行测定。取冻存的海马组织                  较，阳性对照组和秫米提取物高剂量组小鼠血清中上述
          样本 30 mg，经蛋白提取、BCA 蛋白浓度定量及煮沸 5                      指标水平均被显著逆转（P＜0.05或P＜0.01）；秫米提取
          min 变性后，上样 10 μg 蛋白进行 10% 十二烷基硫酸钠-                  物中剂量组小鼠血清中5-HT、IL-2、Bax含量均被显著逆
          聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离（浓缩胶电压 80                      转（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表2。
          V、电泳时间 20 min，分离胶电压 120 V、电泳时间 90                   3.4 秫米提取物对小鼠海马组织中5-HT和5-HTAA含
          min），然后转移至硝酸纤维素（NC）膜（转膜电流 300                       量的影响
          mA，转膜时间 120 min），以 5% 脱脂奶粉封闭 2 h；加入                     与空白组比较，模型组小鼠海马组织中 5-HT 和 5-
          PI3K、p-PI3K 、Akt、p-Akt、NF-κB p65、p-NF-κB p65一抗      HTAA 含量均显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，阳性
         （稀释比例均为 1∶1 000）和 β-actin 一抗（稀释比例为 1∶                对照组和秫米提取物高剂量组小鼠海马组织中5-HTAA
          2 000），4 ℃孵育过夜；TBST清洗4次后，加入HRP标记                    含量显著升高（P＜0.05）。结果见表3。


          · 324 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 3                               中国药房  2024年第35卷第3期
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