Page 59 - 《中国药房》2024年2期
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给药后，按照试剂盒说明书加入 CCK-8 溶液，同时设置                       细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，依次加入PBS 200
          空白组（培养基 100 μL+CCK-8 溶液 10 μL），继续孵育                μL、Annexin Ⅴ-FITC 10 μL 和 PI 10 μL 重悬细胞，4 ℃
          3 h 后于 450 nm 波长处测定吸光度（OD）值。细胞的相                   避光孵育30 min后加入PBS 200 μL，通过流式细胞仪检
          对存活率＝（实验组OD－空白组OD）/（对照组OD－空                        测细胞凋亡率，使用NovoExpress软件分析数据。
          白组OD）×100%。                                        2.3.3 细胞活力的检测
          2.2 低氧条件下 PAECs 中 PPARδ 蛋白表达水平的                        采用 CCK-8 试剂盒检测细胞活力。细胞以 5×10                3
          检测                                                 个/孔均匀接种于96孔板，每组设6个复孔。按“2.3.1”项
          2.2.1 实验分组与给药                                      下方法分组及给药后，按“2.1.2”项下方法操作，检测细
              将细胞分为对照组（常氧+0.1%DMSO）、低氧组（低                    胞存活率。
          氧+0.1%DMSO）、GW501516 干预组（低氧+100 nmol/L             2.3.4 LDH活性的检测
          GW501516），低氧刺激时间为 24 h。低氧刺激前 1 h 用                     使用LDH检测试剂盒检测细胞中LDH活性。细胞
                                                                    3
          GW501516 孵育 PAECs，当 PAECs 融合度达到 80%～               以5×10 个/孔均匀接种于96孔板，每组设6个复孔。按
          90% 时，1∶2 传代培养。各组细胞在低氧刺激前用不含                      “2.3.1”项下方法分组及给药后，每孔加入 LDH 释放液
          胎牛血清的DMEM培养基培养12 h使细胞同步化。模                         10 μL，孵育1 h后以400×g 离心5 min，取上清液，按试

          拟低氧条件为含1%O2、5%CO2和94%N2的空气，模拟常                     剂盒说明书加入 LDH 检测液后，于 450 nm 波长处测定
          氧为含5%CO2的空气（下同）。                                   OD，检测LDH活性。
          2.2.2 PAECs中PPARδ蛋白表达水平的检测                         2.3.5 ROS水平的检测
              采用 Western blot 法检测 PPARδ 蛋白的表达水平。                 采用二乙酰二氯氢化荧光素（DCFH-DA）探针联合
                                                                                                       4
          细胞以 1.5×10 个/孔均匀接种于 6 孔板，每组设 3 个复                  荧光酶标仪测定细胞内ROS水平。细胞以3×10 个/孔
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          孔。按“2.2.1”项下方法分组及给药后，使用细胞裂解液                       均匀接种于24孔板，每组设6个复孔。按“2.3.1”项下方
          裂解细胞提取细胞总蛋白，通过 BCA 试剂盒检测细胞                         法分组及给药后，吸出培养基，加入10 μmol/L无血清培
          总蛋白浓度。采用沸水浴灭活蛋白，上样前将各组细胞                           养基稀释的DCFH-DA，37 ℃孵育20 min后将培养基吸
          蛋白稀释成相同浓度，每个样本取15 µg总蛋白加样，并                        出，PBS 洗涤 3 次后，置于荧光酶标仪（激发波长为 488
          用 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，再转移至聚                         nm，发射波长为525 nm）下检测细胞内ROS水平。
          偏氟乙烯膜中，用 5% 脱脂奶粉室温封闭 2 h，TBST 缓                    2.4 GW501516对低氧致PAECs损伤的作用机制研究
          冲液洗膜，接着加入 PPARδ、GAPDH 一抗（稀释比分别                     2.4.1 实验分组与给药
          为 1∶1 000、1∶5 000），4 °C 孵育过夜；洗膜后加入二抗                   将细胞分为对照组（常氧+0.1%DMSO）、低氧组（低
         （稀释比为 1∶10 000），然后于室温下孵育 1 h，TBST 缓                 氧 +0.1%DMSO）、DMF 干 预 组（阳 性 对 照 ，低 氧 +75
                                                                        [8]
          冲液洗膜后，滴加ECL混合溶液，暗室中曝光，测定蛋白                         µmol/L DMF ）、GW501516 干预组（低氧+100 nmol/L
          条带灰度值。以 PPARδ 和 GAPDH 条带灰度值的比值                     GW501516）、GW501516+ML385 干 预 组（低 氧 +100
          表示PPARδ蛋白的表达水平。                                    nmol/L GW501516+5 μmol/L ML385 ）。各药物干预组
                                                                                            [9]
          2.3 低氧条件下 PAECs 的凋亡率、细胞活力、LDH 活                    在低氧刺激前 1 h 给予不同药物孵育 PAECs，低氧刺激
          性和ROS水平的检测                                         时间为24 h。
          2.3.1 实验分组与给药                                      2.4.2 PAECs中HO-1蛋白和细胞核内Nrf2蛋白表达水
              将细胞分为对照组（常氧+0.1%DMSO）、低氧组（低                    平的检测
          氧 +0.1%DMSO）、NAC 干 预 组（阳 性 对 照 ，低 氧 +10                采用 Western blot 法检测 HO-1 蛋白和 Nrf2 蛋白的
                     [7]
          mmol/L NAC ）、GW501516 干预组（低氧+100 nmol/L            表达水平。细胞以 1.5×10 个/孔均匀接种于 6 孔板，每
                                                                                    5
          GW501516）。各药物干预组在低氧刺激前1 h给予不同                      组设 3 个复孔。按“2.4.1”项下方法分组及给药后，使用
          药物孵育PAECs，低氧刺激时间为24 h。                             细胞裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白，使用细胞核蛋白
          2.3.2 细胞凋亡率的检测                                     与细胞浆蛋白抽提试剂盒提取细胞核蛋白。按“2.2.2”
              采用Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒联合                 项下方法检测HO-1蛋白和Nrf2蛋白的表达水平，HO-1、
                                                    5
          流式细胞仪检测细胞凋亡情况。细胞以 1.5×10 个/孔                       Nrf2、Lamin B1 和 GAPDH 的稀释比例分别为 1∶1 000、
          均匀接种于 6 孔板，每组设 3 个复孔。按“2.3.1”项下方                   1∶1 000、1∶2 000、1∶5 000，以HO-1蛋白与GAPDH蛋白
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          法分组及给药后，以胰酶消化收集细胞，取约 1×10 个                        的灰度值比值表示 HO-1 蛋白的表达水平，以 Nrf2 蛋白

          中国药房  2024年第35卷第2期                                                 China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 2    · 181 ·
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