Page 59 - 《中国药房》2024年1期
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          氮磺胺吡啶组（阳性对照组，500 mg/kg ，临用时以生理                     灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（GAPDH）的灰度值比
          盐水溶解），每组 14 只。另取 14 只大鼠作为对照组（大                     值表示其表达水平。
          鼠肠腔内使用相同方法注入等体积生理盐水）。除对照                           2.6 大鼠粪便的16S rRNA测序
          组、模型组灌胃等量生理盐水外，其余各组大鼠灌胃相                               根据粪便DNA提取试剂盒提取大鼠粪便微生物的
                                                                                            TM
          应药液，灌胃体积为10 mL/kg，每天1次，连续2周。                       总DNA，经凝胶电泳后根据Quant-iT  dsDNA分析试剂
          2.2 大鼠一般情况观察、样本采集及结肠黏膜损伤指数                         盒对细菌 16S rRNA V3-V4 区序列进行扩增（正向引物
          评分                                                 为 5′-GTGTCAGCGCCGCGGTAA-3′，反 向 引 物 为
              在末次给药 1 h 后，将大鼠置于无菌垫料笼内单独                      5′-CGACTACGGGTTCTAATG-3′）。收集扩增产物，通
          喂养，用灭菌镊子夹取大鼠粪便（约1 g/只）放入无菌EP                       过上海美吉生物公司的Illumina MiSeq PE300测序平台
          管内，并立刻放入－80 ℃冰箱内保存。在末次给药结束                         测序，以97%的相似性聚类成操作分类单元（operational
          24 h 后记录大鼠的精神状态、行为活动、体重等一般情                        taxonomic units，OTU），以 OTU 为基本单位分析菌群
          况。将大鼠麻醉处死后，取距肛门8 cm处的结肠组织进                         组成。
          行结肠黏膜损伤指数（colonic mucosal damage index，            2.7 统计学方法
          CMDI）评分[黏膜无损伤为0分；黏膜存在水肿和充血且                            采用 SPSS 25.0 软件进行统计分析。计量资料以
          无溃疡为1分；黏膜存在水肿和充血且糜烂为2分；黏膜                          x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两
          存在水肿和充血及单个溃疡（溃疡直径＜1 cm）为 3 分；                      组间比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
          黏膜存在水肿和充血及多个溃疡（溃疡直径＜1 cm）为4                        3 结果
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          分；黏膜存在水肿和充血及直径＞1 cm的溃疡为5分] 。                       3.1 柠檬苦素对 UC 模型大鼠一般情况及 CMDI 评分
          CMDI评分完毕后将部分结肠组织固定在4%多聚甲醛                          的影响
          中，用于HE染色；剩余结肠组织保存于－70 ℃条件下，                            与对照组相比，模型组大鼠精神状态不佳、皮毛较
          用于ELISA和Western bolt检测。                            暗、情绪烦躁易发怒、活动较少，体重显著降低，CMDI评
          2.3 大鼠结肠组织中炎症因子水平的检测                               分显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，柠檬苦素各剂
              采用 ELISA 法检测。将－70 ℃条件下保存的结肠                    量组大鼠的精神状态、皮毛光泽以及活动量均改善，体
          组织匀浆后，在4 ℃下以4 100 r/min离心12 min获得上                 重均显著升高，CMDI 评分均显著降低（P＜0.05），且具
          清液，根据相关试剂盒说明书方法检测结肠组织中炎症                           有剂量依赖性（P＜0.05）；柳氮磺胺吡啶组大鼠精神状
          因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。                             态、皮毛光泽以及活动量也均改善，体重显著升高，
          2.4 大鼠结肠组织病理形态观察                                   CMDI 评分显著降低（P＜0.05）。柳氮磺胺吡啶组与柠
              取固定在 4% 多聚甲醛中的大鼠结肠组织适量，制                       檬苦素高剂量组相比，大鼠体重和CMDI评分的差异无
          作石蜡切片，用二甲苯脱蜡，并通过梯度乙醇进行水合，                          统计学意义（P＞0.05）。结果见表1。
          经HE染色后用二甲苯使其透明，并以中性树脂密封，然                          表1 各组大鼠体重和 CMDI 评分的比较结果（x±s，
          后在显微镜下观察大鼠结肠组织病理变化。                                     n＝14）
          2.5  大 鼠 结 肠 组 织 中 肠 道 屏 障 功 能 相 关 蛋 白 及            组别                       体重/g         CMDI评分/分
          HMGB1、RAGE蛋白表达的检测                                   对照组                    340.01±37.34   0.00±0.00
                                                              模型组                    235.93±23.38 a  4.14±0.52 a
              采用Western bolt法检测。取－70 ℃条件下保存的                  柠檬苦素低剂量组               263.15±25.23 b  3.28±0.41 b
          大鼠结肠组织适量，采用蛋白提取试剂盒提取总蛋白，                            柠檬苦素中剂量组               291.21±29.01 bc  2.55±0.36 bc
                                                              柠檬苦素高剂量组               316.38±32.58 bcd  1.91±0.23 bcd
          采用BCA试剂盒定量蛋白浓度。蛋白变性后，取30 μg                         柳氮磺胺吡啶组                318.32±35.07 bcd  1.93±0.27 bcd
          进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和转膜，以                              a：与对照组相比，P＜0.05；b：与模型组相比，P＜0.05；c：与柠檬苦
          5% 脱脂奶粉封闭，加入 Claudin-1（稀释度为 1∶1 400）、              素低剂量组相比，P＜0.05；d：与柠檬苦素中剂量组相比，P＜0.05。
          Occludin（稀释度为1∶1 200）、ZO-1（稀释度为1∶1 200）、           3.2 柠檬苦素对 UC 模型大鼠结肠组织中炎症因子水
          HMGB1（稀释度为1∶2 000）、RAGE（稀释度为1∶1 500）、              平的影响
          GAPDH（稀释度为1∶1 800）一抗，4 °C下孵育过夜；然后                      与对照组相比，模型组大鼠结肠组织中IL-1β、IL-6、
          加入二抗（稀释度为 1∶4 200），37 °C 下孵育 2 h；经 ECL             TNF-α 水平均显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，柠
          试剂显色后，进行凝胶成像，采用Image J软件分析蛋白                       檬苦素各剂量组大鼠结肠组织中上述指标水平均显著


          中国药房  2024年第35卷第1期                                                  China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 1    · 53 ·
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