Page 41 - 《中国药房》2024年1期

2.4 HMC3细胞迁移能力的检测 3 结果
采用 Transwell 小室法检测。将 HMC3 细胞接种于 3.1 麻黄碱对HMC3细胞活力和凋亡的影响
24 孔板，分为对照组（不接受药物处理）、LPS 组（接受 1 与对照组相比，LPS 组细胞活力显著降低，细胞凋
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μg/mL LPS处理 ）、麻黄碱组（同时接受1 μg/mL LPS和 亡率显著升高（P＜0.05）；与LPS组相比，LPS+300 μg/mL
300 μg/mL 麻黄碱处理）、BAY11-7082 组（同时接受 1 麻黄碱组细胞活力显著升高，细胞凋亡率显著降低（P＜
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μg/mL LPS 和 5 μmol/L BAY11-7082 处理）、抑制剂组 0.05）。结果见图1、图2。基于此，本研究选择300 μg/mL
（同时接受 1 μg/mL LPS、300 μg/mL 麻黄碱和 5 μmol/L 麻黄碱进行后续细胞功能实验。

BAY11-7082处理）和激活剂组（同时接受1 μg/mL LPS、 150
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300 μg/mL 麻黄碱和 1 μmol/L Prostratin 处理）。各组
加入相应药物培养 24 h 后，收集细胞，分别制备成细胞 100 a b
悬液，备用。将Transwell小室放入24孔板，在Transwell 细胞活力/%
小室的上室中，每孔加入200 μL上述各组细胞悬液（1× 50
6
10 个/mL），下室加入600 μL含有10%FBS的培养基，培
0
养24 h；取出Transwell小室，弃上清液，用棉签擦去小室 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ
Ⅰ：对照组；Ⅱ：LPS组；Ⅲ：LPS+75 μg/mL麻黄碱组；Ⅳ：LPS+150
薄膜上层细胞，以 PBS 清洗后，用 4% 甲醇固定 30 min。
μg/mL麻黄碱组；Ⅴ：LPS+300 μg/mL麻黄碱组；Ⅵ：LPS+600 μg/mL麻
晾干后，用0.1%结晶紫染色10 min，以PBS清洗3次；采 黄碱组；a：与对照组相比，P＜0.05；b：与LPS组相比，P＜0.05。
用显微镜观察并拍照，每孔随机选 5 个不同视野，采用 图1 麻黄碱对HMC3细胞活力的影响结果（x±s，n＝3）
ImageJ 1.8.1软件计算迁移细胞数。实验重复3次。
2.5 HMC3 细胞中 sIL-6、IL-10、SOD、MDA 水平的
检测
采用 ELISA 法检测。将 HMC3 细胞接种于 6 孔板，
100 μm 100 μm 100 μm
按“2.4”项下方法分组、给药、培养24 h后，收集细胞，然
对照组 LPS组 LPS+75 μg/mL麻黄碱组
后根据试剂盒说明书方法操作，检测细胞中 sIL-6、IL-
10、SOD、MDA水平。实验重复3次。
2.6 HMC3细胞中NF-κB信号通路相关蛋白表达水平
的检测 100 μm 100 μm 100 μm
采用 Western blot 法进行检测。将 HMC3 细胞接种 LPS+150 μg/mL麻黄碱组 LPS+300 μg/mL麻黄碱组 LPS+600 μg/mL麻黄碱组
于 6 孔板，按“2.4”项下方法分组、给药、培养 24 h 后，以 A. HMC3细胞凋亡的染色图
20
RIPA 裂解液裂解细胞，在 4 ℃条件下以 12 000 r/min 离
a
心10 min后收集上清液，即总蛋白样品。将总蛋白样品 15
进行变性处理，然后采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺 细胞凋亡率/% 10 b
凝胶电泳分离蛋白，再进行转膜。将载有蛋白的 PVDF 5
膜在5%脱脂牛奶中室温封闭1 h后，于4 ℃条件下加入 0
一抗（NF-κB、p-NF-κB和β-actin的稀释度分别为1∶2 000、 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ
B.各组细胞凋亡率的检测结果（x±s，n＝3）
1∶3 000、1∶10 000）孵育过夜，再加入相应二抗室温孵育 Ⅰ：对照组；Ⅱ：LPS组；Ⅲ：LPS+75 μg/mL麻黄碱组；Ⅳ：LPS+150
2 h；经显影处理后，采用凝胶成像系统拍照记录，并用 μg/mL麻黄碱组；Ⅴ：LPS+300 μg/mL麻黄碱组；Ⅵ：LPS+600 μg/mL麻
黄碱组；a：与对照组相比，P＜0.05；b：与LPS组相比，P＜0.05。
ImageJ 1.8.1 软件进行分析，以 β-actin 为内参，以 NF-κB
图2 麻黄碱对HMC3细胞凋亡的影响结果
与 p-NF-κB 的灰度值比值表示 NF-κB 蛋白的磷酸化
水平。 3.2 麻黄碱对HMC3细胞迁移能力的影响
2.7 统计学方法 与对照组相比，LPS 组迁移细胞数显著增多（P＜
采用 SPSS 26.0 软件对数据进行统计分析，符合正 0.05）。与 LPS 组相比，麻黄碱组和 BAY11-7082 组迁移
态分布的计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素 细胞数显著减少（P＜0.05）。与麻黄碱组相比，抑制剂
方差分析，进一步两两比较采用Dunnett’s t检验。检验 组迁移细胞数显著减少（P＜0.05），而激活剂组迁移细
水准α＝0.05。 胞数显著增多（P＜0.05）。结果见图3。

中国药房 2024年第35卷第1期 China Pharmacy 2024 Vol. 35 No. 1 · 35 ·