Page 46 - 《中国药房》2024年1期
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为大鼠逃避潜伏期。若大鼠5 min内没有完成独立登台                          drophilic interaction chromatography，HILIC）柱负离子电
          则逃避潜伏期记为5 min，需辅助大鼠停驻平台20 s。每                       喷 雾 方 法 —— 采 用 HILIC 柱（2.1  mm×150  mm，1.7
          天测量3个象限（平台所在象限不测），最终用4 d的逃避                         μm），以含10 mmol/L甲酸铵的乙腈-水-甲醇（乙腈、水、
          潜伏期数据作为判断大鼠学习能力的指标。在夹尾刺                             甲醇体积比为 80∶15∶5）溶液为流动相 A、含 10 mmol/L
          激第20天时进行为期1 d的空间探索实验：先将平台移                          甲酸铵的乙腈-水（含50%乙腈）溶液为流动相B进行梯
          除，沿第一象限池壁将大鼠放入池内，将大鼠5 min内穿                         度洗脱（0～4 min，100%B→80%B；4～5.5 min，80%B→
          越平台所在区域的次数作为评定大鼠空间记忆能力的                             20%B；5.5～7 min，20%B）。4种方法的柱温均为40 ℃，
          指标。                                                 流速均为0.35 mL/min，进样量均为5 μL。
          2.4 睡眠监测                                                扫描模式为全扫描和数据依赖性的二级扫描。离
              在全部行为学实验完成后，将大鼠放入无创睡眠活                          子源模式根据不同液相方法采取正离子电子喷雾（ESI）
                                                                                                            +
          动监测系统，每只大鼠单独关在1个笼子里。白天采用                            或负离子电子喷雾（ESI ）。一级MS扫描范围为质荷比
                                                                                  －
          自然光线，晚上7：00后使用窗帘制造完全黑暗的环境。                         （m/z）70～1 000，喷雾电压为 4 000 V，毛细管温度为
          监测大鼠24 h的睡眠时间，计算各组大鼠的平均24 h睡                        350 ℃，鞘气压力为60 arb，流速为40 L/min，辅助气压力
          眠时间百分比：大鼠的平均24 h睡眠时间百分比（%）＝                         为 20 arb，流速为 5 L/min，碰撞电压为 60 eV；采用数据
          各组大鼠24 h内平均睡眠时间/24 h×100%。
                                                              依赖性的扫描模式采集二级 MS，采集范围为 m/z 70～
          2.5 样本收集与处理                                         1 000，碰撞电压为60 eV。
              末次给药 24 h 后，经大鼠腹主动脉收集血液，在冰
                                                              2.7 数据处理与分析
          台上处死大鼠并快速分离海马组织。血液经3 500 r/min
                                                                  睡眠监测和行为学数据统计由 SPSS 22.0 软件完
          离心15 min制备血清。将血清和海马组织用液氮速冻，
                                                              成，实验结果用x±s表示。多组间比较采用单因素方差
          于－80 ℃冰箱中保存。
                                                              分析，组间两两比较采用LSD检验。检验水准α＝0.05。
          2.6 血清和海马组织代谢组学分析
                                                                  在统计分析代谢数据之前，先对原始峰面积进行归
              将“2.5”项下海马组织样本在 4 ℃条件下缓慢解冻
                                                              一化处理，以适应不同运行日之间的系统波动。然后对
          后（海马组织经钢珠匀浆后取匀浆液），按照1∶4（V/V）的
                                                              归一化后的峰面积进行对数转换（log2 ），以降低数值的
          比例，向样本中加入甲醇。振荡3 min混匀后，设置离心
                                                              偏态分布，并使其呈近似正态分布。使用所有样本中某
          机参数为温度 20 ℃、转速 4 000 r/min，离心 10 min 沉淀
                                                              一代谢产物的最小检测值估算峰面积矩阵中的缺失值。
          不溶物。离心完成后从每个样品中取 4 份（各 100 μL）
                                                              代谢数据通过无监督的主成分分析（principal compo‐
          上清液至4个样板中，以氮气吹干，用于后续UPLC-MS/
                                                              nent analysis，PCA）和有监督的正交偏最小二乘判别分
          MS检测。
                                                              析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，
              为实现最大限度的代谢物覆盖，本研究基于 UPLC
                                                              OPLS-DA）进行分析，组间差异代谢物根据 Wilcoxon
          结合高分辨MS平台，依据代谢物性质差异，采用4种不
                                                              符 号秩和检验 P＜0.05 和代谢物差异倍数≥1.2 或≤
          同的UPLC-MS/MS方法进行检测。方法1：强极性反相
                                                                    [10]
                                                              0.833 3 为标准进行筛选。代谢数据的统计分析和
          柱正离子电喷雾方法——采用C18色谱柱（2.1 mm×100
                                                              数据可视化均使用 R 3.4.1 软件完成。基于京都基因与
          mm，1.7 mm），以含 0.05% 全氟戊酸和 0.1% 甲酸的水溶
                                                              基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and ge‐
          液为流动相A、含0.05%全氟戊酸和0.1%甲酸的甲醇为
                                                              nomes，KEGG）数据库和R 3.4.1软件中的Pathview工具
          流动相 B 进行梯度洗脱（0～4 min，0→70%B；4～5.5
          min，70%B→98%B；5.5～7 min，98%B）。方法2：弱极性               包和MetPA工具包进行通路富集分析。
          反 相 柱 正 离 子 电 喷 雾 方 法 —— 采 用 C18 色 谱 柱（2.1          3 结果
          mm×100 mm，1.7 mm），以含0.05%全氟戊酸和0.1%甲                 3.1 行为学评价结果
          酸的水溶液为流动相A、含0.05%全氟戊酸和0.1%甲酸                            与正常组比较，模型组大鼠逃避潜伏期显著延长
          的甲醇-含50%甲醇的乙腈溶液为流动相B进行梯度洗                          （P＜0.05），穿越平台次数显著减少（P＜0.05）；与模型组
          脱（0～4 min，0→70%B；4～5.5 min，70%B→98%B；5.5～           比较，地西泮组和苏格木勒-4组大鼠的逃避潜伏期显著
          7 min，98%B）。方法 3：反相柱负离子电喷雾方法——                      缩短（P＜0.05），穿越平台次数显著增加（P＜0.05）。结
          采用 C18 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 mm），以含 6.5             果见表1。
          mmol/L碳酸氢铵的水为流动相A、含6.5 mmol/L碳酸氢                    3.2 睡眠监测结果
          铵的甲醇-水（含 95% 甲醇）为流动相 B 进行梯度洗脱                           与正常组[平均 24 h 睡眠时间百分比为（53.17±
         （0～4  min，0→70%B；4～5.5  min，70%B→99.5%B；             1.94）%，n＝6]比较，模型组大鼠平均24 h睡眠时间百分
          5.5～7 min，99.5%B）。方法 4：正向亲水作用色谱（hy‐                 比[（46.83±2.32）%]显著降低（P＜0.05）；与模型组比


          · 40 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 1                                中国药房  2024年第35卷第1期
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