Page 22 - 《中国药房》2023年22期
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TRAF6 WT 或 TRAF6 MUT 的 3′-UTR 片段分别克隆于               细胞均加入无水乙醇 70 μL 以建立急性胃溃疡细胞模
          荧光素酶 pmirGLO 载体上，经 DNA 测序验证后，利用                     型。培养12 h后，收集各组细胞，采用Western blot法检
          Lipofectamine 3000 转染试剂分别将 TRAF6 WT 和 miR-          测各组细胞中 TRAF6 蛋白的表达水平（空白组、空白+
          146a-5p mimic、TRAF6 WT 和 mimic NC、TRAF6 MUT         NC siRNA 组、空白+TRAF6 siRNA 组，具体操作和结果

          和 miR-146a-5p mimic、TRAF6 MUT 和 mimic NC 共转         处理同“2.4”项）以验证 TRAF6 的敲减情况。再采用
          染至正常GES-1细胞中（每组设3个复孔）；24 h后取出，                      ELISA 法检测细胞上清液中 IL-1β、IL-6、PGE2水平（模
          使用多功能酶标仪检测各组细胞的荧光素酶活性。                              型组、模型+mimic NC组、模型+miR-146a-5p mimic组和
          2.6.2 RNA结合蛋白免疫沉淀实验                                 模型组、模型+NC siRNA 组、模型+TRAF6 siRNA 组，具
              将正常GES-1细胞接种于6孔板中并分为不加抗体                        体操作同“2.5”项）。
          的input组（作背景参考）、与正常兔IgG抗体共孵育的阴                       2.8 敲减 miR-146a-5p 对艳山姜总黄酮抗胃溃疡作用
          性对照组和与 TRAF6 抗体共孵育的 anti-TRAF6 组，每                  的影响
          组设3个复孔。收集细胞，使用RNA结合蛋白免疫沉淀                               本研究进一步通过敲减 miR-146a-5p 的方式，观察
          裂解缓冲液裂解；取裂解物 100 μL，与含磁珠的缓冲液                        转染 miR-146a-5p inhibitor 能否逆转艳山姜总黄酮对无
          混合后，与正常兔 IgG 抗体或 TRAF6 抗体（稀释比例均                     水乙醇致胃黏膜细胞损伤的改善作用。取正常 GES-1
          为 1∶200）一起孵育；蛋白经蛋白酶 K 缓冲液消化后，使                      细胞，消化后接种于 6 孔板中，培养 24 h；将细胞分为模
          用 Trizol 试剂盒分离上述抗体结合的 RNA，采用 qRT-                   型+艳山姜总黄酮组、模型+艳山姜总黄酮+inhibitor NC
          PCR 法测定 miR-146a-5p 的表达水平（具体操作和结果                   组、模型+艳山姜总黄酮+miR-146a-5p inhibitor 组，每组
          处理同“2.3”项）。若TRAF6抗体结合的miR-146a-5p的                  设 6 个复孔。除模型+艳山姜总黄酮组外，其余各组分

          表达高于阴性对照，则说明 miR-146a-5p 与 TRAF6 有特                 别利用Lipofectamine 3000转染试剂转染inhibitor NC和
          异性结合。                                               miR-146a-5p inhibitor；24 h 后，各组细胞均用含艳山姜
          2.6.3 Western blot实验                                总黄酮（质量浓度按“2.2.2”项下结果设置）的 RPMI-
              将正常 GES-1 细胞接种于 6 孔板中并分为 mimic                  1640 培养液 200 μL；培养 12 h 后，各组细胞均加入无水
          NC 组、miR-146a-5p mimic 组、inhibitor NC 组和 miR-       乙醇70 μL以建立急性胃溃疡细胞模型。培养12 h后，
          146a-5p  inhibitor 组 ，每 组 设 6 个 复 孔 。 利 用 Lipo‐     收集各组细胞，采用 Western blot 法检测各组细胞中
          fectamine 3000 转染试剂分别转染 mimic NC、miR-146a-          TRAF6 蛋白的表达水平（具体操作和结果处理同“2.4”
          5p mimic、inhibitor NC、miR-146a-5p inhibitor；24 h后，收  项），采用ELISA法检测细胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2
          集各组细胞，采用 Western blot 法检测 TRAF6 蛋白的表                水平（具体操作同“2.5”项）。
          达水平（具体操作和结果处理同“2.4”项）。                              2.9 统计学方法
          2.7 过表达miR-146a-5p或敲减TRAF6对模型细胞上                        采用 SPSS 21.0 软件和 GraphPad Prism 8 软件对数
          清液中IL-1β、IL-6、PGE2影响的检测                             据进行统计分析。所有数据均以x±s表示，多组间比较
              为进一步确认 miR-146a-5p 能否通过 TRAF6 调控                采用单因素方差分析，组间两两比较采用 SNK-q 检验。
          胃溃疡的发生，本研究借助过表达 miR-146a-5p 或敲减                     检验水准α＝0.05。
          靶点 TRAF6 蛋白的方式，观察急性胃溃疡模型细胞上                         3 结果
          清液中IL-1β、IL-6、PGE2的变化情况。取正常GES-1细                   3.1 艳山姜总黄酮对细胞活力的影响及作用浓度筛选
          胞，消化后接种于 6 孔板中，培养 24 h；将细胞分为模型                      结果
          组、模型+mimic NC 组、模型+miR-146a-5p mimic 组（过                随着艳山姜总黄酮质量浓度的升高，各药物组细胞

          表达 miR-146a-5p 实验），以及空白组、空白+NC siRNA                活力均较空白组逐渐降低，但组间比较差异均无统计学
          组、空白+TRAF6 siRNA 组和模型组、模型+NC siRNA                  意义（P＞0.05），详见图1A。与空白组比较，模型组细胞
          组、模型+TRAF6 siRNA组（敲减TRAF6实验），每组设6                   活力显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，模型+艳山姜
          个复孔。除模型组/空白组外，其余各组分别利用 Lipo‐                        总黄酮48、60、80、120 mg/L组细胞活力均显著升高（P＜
          fectamine 3000 转染试剂转染 mimic NC、miR-146a-5p          0.05 或 P＜0.01），详见图 1B。因此，选取对细胞无明显
          mimic、NC siRNA、TRAF6 siRNA；24 h 后，除空白组、空            毒性但能改善无水乙醇所致损伤的60 mg/L作为后续实
          白+NC siRNA 组、空白+TRAF6 siRNA 组外的其余各组                 验艳山姜总黄酮的作用浓度。


          · 2704 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 22                            中国药房  2023年第34卷第22期
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