Page 21 - 《中国药房》2023年22期
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物科技有限公司；MTT 试剂（货号 SR0051）购自南京都                     2.3 细胞中miR-146a-5p表达水平的检测
          莱生物技术有限公司；ECL 化学发光试剂盒（批号                               采用 qRT-PCR 法进行检测。将正常 GES-1 细胞接
          P0018S）购自上海碧云天生物技术有限公司；青-链霉素                       种于96孔板中并分为空白组、模型组和模型+艳山姜总
          双抗、0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）消化液、蛋                     黄酮组（质量浓度按“2.2.2”项下结果设置），每组设 6 个
          白裂解液、双荧光素酶报告基因检测试剂盒（批号                             复孔。按“2.2.2”项下方法培养、处理后，收集各组细胞，
          D0010）均购自北京索莱宝科技有限公司；RPMI-1640培                    提取总 RNA 并使用逆转录试剂盒处理得到 cDNA。以
          养液、胎牛血清均购自美国HyClone公司。                             所得 cDNA 为模板，进行 PCR 扩增。反应体系（20 μL）
          1.3 细胞                                             包括：cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，水8 μL，
              人胃黏膜细胞 GES-1（货号 BFN60807461）购自美                2×Mix 10 μL。miR-146a-5p的上游引物为5′-AGAAC-
          国ATCC细胞库。                                          TGAATTCCATGGGTT-3′，下游引物为 5′-GACAGAG-
          2 方法                                               ATATCCCAGCTGAAGAA-3′，产物长度为 397 bp；U6
          2.1 艳山姜总黄酮的制备                                      的上游引物为 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游
              取艳山姜药材，粉碎，取粗粉 100 g，用 95% 乙醇                   引物为 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，产物长度
          1 000 mL加热回流提取2 h×3次；合并提取液，过滤，浓                    为94 bp。反应条件如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性
          缩，制得浸膏（浸膏得率 18.69%）。取上述浸膏，用适量                      15 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，进行 35 个循环；
          水溶解，再加入适量乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃                          72 ℃再延伸 5 min。以 U6 为内参，使用 2           －ΔΔCt  法计算
          取液，浓缩，制得总黄酮浸膏[总黄酮浸膏得率2.28%，纯                       miR-146a-5p 的相对表达量，结果以空白组为参照进行
          度 42.61%（以芦丁计）]，再用水溶解，制成质量浓度为                      归一化处理。
          30 mg/mL（按生药量计）的艳山姜总黄酮溶液，备用。                       2.4 细胞中 NF-κB p65、TRAF6、TNF-α 蛋白表达水平
          2.2 艳山姜总黄酮对细胞活力影响的考察及作用浓度                          的检测
          的筛选                                                    采用Western blot法进行检测。收集“2.3”项下空白
          2.2.1 对细胞活力影响的考察                                   组、模型组、模型+艳山姜总黄酮组细胞，以RIPA裂解液
              将正常 GES-1 细胞接种于 96 孔板中并分为空白组                   裂解、提取细胞中的总蛋白，以 BCA 法测定蛋白浓度
          和艳山姜总黄酮不同质量浓度组（24、48、60、80、120                     后，于 100 ℃下加热 5 min 变性；取变性蛋白适量，经十
          mg/L，质量浓度按前期预实验结果设置），每组设6个复                        二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转膜，以5%
          孔。空白组加入 RPMI-1640 培养液（含青-链霉素双抗                     脱 脂 奶 粉 室 温 封 闭 1  h；加 入 GAPDH、NF- κB  p65、
          和10%胎牛血清）20 μL，其余各组分别加入含不同质量                       TRAF6、TNF-α一抗（稀释比例分别为1∶20 000、1∶1 000、
          浓度艳山姜总黄酮的 RPMI-1640 培养液 20 μL；培养 24                1∶2 000、1∶2 000），于 4 ℃下孵育过夜；加入相应二抗
                                    [9]
          h 后，每孔加入 MTT 溶液 20 μL ；孵育 4 h 后，吸弃培养              （稀释比例为 1∶1 000），于室温下孵育 1 h；用 ECL 试剂
          液，加入二甲基亚砜150 μL，振荡15 min后，使用酶标仪                    显影后，使用凝胶成像仪检测并使用Image-Pro Plus 6软
          在490 nm波长处检测各孔的光密度（OD）值并按下式计                       件进行分析，以目的蛋白灰度值与内参蛋白（GAPDH）
          算各组细胞活力：细胞活力＝实验组 OD 值/空白组 OD                       灰度值的比值作为目的蛋白的表达水平，结果以空白组
          值×100%。                                            为参照进行归一化处理。
          2.2.2 作用浓度的筛选                                      2.5 细胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的检测
              将正常GES-1细胞接种于96孔板中并分为空白组、                          采用 ELISA 法进行检测。收集“2.3”项下空白组、
          模型组和模型+艳山姜总黄酮不同质量浓度组（24、48、                        模型组、模型+艳山姜总黄酮组细胞上清液，参照相应试
          60、80、120 mg/L，质量浓度按前期预实验结果设置），每                   剂盒说明书方法，使用酶标仪检测各组细胞上清液中
          组设6个复孔。空白组和模型组加入RPMI-1640培养液                       IL-1β、IL-6、PGE2水平。
         （含青-链霉素双抗和10%胎牛血清）20 μL；各药物组加                       2.6 miR-146a-5p与TRAF6靶向关系的验证
          入含不同质量浓度艳山姜总黄酮的 RPMI-1640 培养液                      2.6.1 双荧光素酶报告基因实验
          20 μL；培养12 h后，模型组和各药物组分别加入无水乙                          本课题组前期采用 Targetscan 预测软件，设置物种
          醇7 μL以建立急性胃溃疡细胞模型，空白组加入RPMI-                       为“human”，依据“context score”进行 miR-146a-5p 靶点
          1640 培养液（含青-链霉素双抗和 10% 胎牛血清）7 μL；                  筛选（评分越低则靶向的可能性越大），结果显示，miR-
          培养 12 h 后，每孔加入 MTT 溶液 20 μL，按“2.2.1”项下             146a-5p能够与TRAF6的3′-UTR结合，提示两者存在靶
          方法检测各组细胞活力，以确定后续实验中艳山姜总黄                           向关系。为进一步确认两者关系，本研究采用双荧光素
          酮的最适作用浓度。                                          酶 报 告 基 因 实 验 进 行 验 证 ：将 含 有 预 测 结 合 位 点


          中国药房  2023年第34卷第22期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 22    · 2703 ·
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