Page 48 - 《中国药房》2023年19期

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盐水，当归多糖组大鼠灌胃 200 mg/kg 当归多糖 +腹腔 2.7 大鼠子宫组织中 PI3K/AKT 信号通路相关蛋白表
注射10 mL/kg生理盐水，LY294002组大鼠灌胃10 mL/kg 达测定
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生理盐水+腹腔注射 5 mg/kg LY294002 ，当归多糖+ 取“2.2”项下各组大鼠的子宫组织，提取其总蛋白并
LY294002 组大鼠灌胃 200 mg/kg 当归多糖+腹腔注射 5 于沸水浴中加热变性，对总蛋白进行定量分析。取 20
mg/kg LY294002；每天给药 1 次，连续给药 7 d。于妊娠 µg 总蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
（在 120 V 恒压下电泳 80 min），然后在 40 mA 稳定电流
第8天，模型组和各给药组大鼠参照文献[8]制备先兆流
下湿转90 min至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，以3%牛血
产大鼠模型，即上午8：00灌胃8.3 mg/kg米非司酮，并于
清白蛋白封闭 2 h；依次加入兔源抗大鼠 p-PI3K、PI3K、
下午6：00灌胃100 μg/kg米索前列醇诱发先兆流产。对
p-AKT、AKT、GAPDH 一抗（稀释比例均为 1∶2 000），
照组大鼠以同样步骤灌胃等量生理盐水。然后于妊娠
4 ℃孵育过夜；洗膜后，加入HRP标记的山羊抗兔IgG二
第9天，各组大鼠继续按照上述给药方法给药4 d。
抗（稀释比例为1∶1 000），室温孵育2 h。化学发光法显色
2.2 样本收集及处理
后采集各组蛋白条带图像，运用Image-pro 6.0图像分析
于妊娠第13天，通过吸入乙醚麻醉各组大鼠后自腹
软件分析条带灰度值。以目的蛋白和内参蛋白（GAPDH）
主动脉采集血液，离心后分组采集血清保存在－80 ℃冰 条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平，PI3K、
箱中备用；再次采集适量腹主动脉血，按 PBMC 分离试 AKT的磷酸化水平分别以p-PI3K与PI3K相对表达水平
剂盒说明书方法操作分离出其中PBMC，以含有10%胎 的比值和p-AKT与AKT相对表达水平的比值表示。
牛血清的RPMI-1640培养基培养备用；称定大鼠体重后 2.8 统计学分析
断头处死，开腹摘取子宫及卵巢备用。 采用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料采用
2.3 大鼠血清中激素和Th1、Th2型细胞因子水平测定 x±s 表示，组间比较采用单因素方差分析和 SNK-q 检
取“2.2”项下大鼠血清于冰水浴中解冻后，按照 验。检验水准α＝0.05。
ELISA 试剂盒方法检测血清中雌激素、孕激素、IFN-γ、 3 结果
TNF-α、IL-4水平。 3.1 大鼠血清中雌激素与孕激素水平测定结果
2.4 大鼠子宫卵巢指数及胚胎死亡率测定 与对照组比较，模型组大鼠血清中雌激素、孕激素
取“2.2”项下各组大鼠的子宫及卵巢，使用小剪刀剪 水平均显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，当归多糖
组大鼠血清中雌激素、孕激素水平均显著升高（P＜
开子宫后观察胚胎生长情况并计数，正常发育胚胎呈淡
0.05），而LY294002组大鼠血清中雌激素、孕激素水平均
红色且个体较大，胎鼠轮廓清晰且胎膜完整；死亡胚胎
显著降低（P＜0.05）。与当归多糖组比较，当归多糖+
个体小并呈“竹节状”，胎膜结构不完整或不存在，胚胎
LY294002 组大鼠血清中雌激素、孕激素水平均显著降
呈黑褐色并有消失迹象或已经消失。按下述公式计算
低（P＜0.05）。结果见表1。
各组孕鼠胚胎死亡率：胚胎死亡率＝死亡胚胎数/（正常
表1 各组大鼠血清中激素和 Th1、Th2 型细胞因子水
胚胎数+死亡胚胎数）×100%。取出胚胎后，剥离宫腔
平测定结果（x±s，n＝10，pg/mL）
及卵巢的脂肪组织，称定子宫和卵巢质量，按下述公式
组别 雌激素 孕激素 IFN-γ TNF-α IL-4
计算各组孕鼠子宫卵巢指数：子宫卵巢指数（mg/g）＝ 对照组 1.28±0.14 154.81±32.40 2.64±0.35 23.79±4.10 19.84±3.59
[子宫质量+卵巢质量（mg）]/体重（g）。 模型组 0.59±0.07 a 83.25±11.73 a 5.87±0.63 a 64.82±8.25 a 6.23±1.02 a
当归多糖组 1.23±0.16 b 146.34±30.12 b 2.95±0.40 b 29.35±4.33 b 17.52±3.14 b
2.5 大鼠子宫组织形态观察 LY294002组 0.29±0.05 b 27.96±5.50 b 7.74±0.75 b 86.43±9.41 b 2.20±0.43 b
剪下“2.2”项下各组大鼠的一部分子宫组织，包埋后 当归多糖+LY294002组 0.63±0.08 c 91.12±12.06 c 5.53±0.58 c 56.10±7.94 c 7.49±1.15 c
于液氮内速冻，修剪为小方块后置于冰冻切片机内进行 a：与对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与当归多
糖组比较，P＜0.05。
连续切片，得到厚约5 µm的切片进行复温；以预冷丙酮
3.2 大鼠血清中Th1、Th2型细胞因子水平测定结果
固定10 min，再进行HE染色，经洗涤、封片后，采用光学
与对照组比较，模型组大鼠血清中IFN-γ、TNF-α水
显微镜观察并任选6个视野采集图像。
平均显著升高（P＜0.05），IL-4水平显著降低（P＜0.05）。
2.6 大鼠外周血中Th1、Th2细胞比例及两者比值测定
与模型组比较，当归多糖组大鼠血清中IFN-γ、TNF-α水
取“2.2”项下各组大鼠的 PBMC 并计数，每组取约 平均显著降低（P＜0.05），IL-4水平显著升高（P＜0.05）；
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2×10 个 PBMC，以 FITC 标记的抗大鼠 CD4 抗体孵育， 而LY294002组大鼠血清中IFN-γ、TNF-α水平均显著升
洗涤后以固定/透化稀释液和透化缓冲液孵育；依次孵育 高（P＜0.05），IL-4 水平显著降低（P＜0.05）。与当归多
APC 标记的抗大鼠 IFN-γ 抗体和 PE 标记的抗大鼠 IL-4 糖组比较，当归多糖+LY294002 组大鼠血清中 IFN-γ、
抗体，再次洗涤后用流式细胞仪检测其中Th1、Th2细胞 TNF-α 水平均显著升高（P＜0.05），IL-4 水平显著降低
的比例并计算Th1/Th2比值。 （P＜0.05）。结果见表1。

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