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2.6 裸鼠肿瘤组织中 miRNA-155 和 Wnt7、β-catenin、
          TCF-4 mRNA表达水平的检测
              采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）法
          进行检测。取各组裸鼠肿瘤组织各 20 mg，加入 Trizol
          裂解液1 mL后提取总RNA；取适量总RNA将其反转录
          成 cDNA，然后进行 PCR 扩增。PCR 反应条件为：95 ℃                                     100 μm                  100 μm
          预 变 性 30  s；95  ℃ 变 性 15  s；循 环 60 次 。 以 U6 或                第1天                     第7天
          GAPDH为内参，采用2       －ΔΔCt 法计算miRNA-155和目的基
          因 mRNA 的表达水平。PCR 引物序列及扩增产物长度
          见表1。
                 表1 PCR引物序列及扩增产物长度
          基因名称  引物序列（5′→3′）                       扩增产物长度/bp
                                                                               100 μm                   100 μm
          miRNA-155 上游：ACACTCCAGCTGGGCTGTTAATGCTAATTGTGATAGGGGTTTTGG-   73
                CCTCT GACTGACTCCTACCTGTTAGCAT                          第12天                    第19天
                下游：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTGTTAAT  图1 miRNA-155过表达AGS细胞株的构建过程
          Wnt7  上游：TGGACGAGTGTCAGTTTCA               19
                下游：CCACAGTCGCTCAGGTTGC                       3.2 裸鼠肿瘤组织生长情况的观察结果
          β-catenin  上游：AGCGACTAAGCAGGAAGGG          19          与模型组比较，过表达组、对照组和清热化湿方中、
                下游：GAAGAGCACAGATGGCAGG                       高剂量组裸鼠肿瘤组织质量均显著降低（P＜0.05），肿
          TCF-4  上游：GGGCTCCCCTCCTTCACTCT             20
                下游：GCTACCCATCGCTCCGTTGT                      瘤抑制率分别为 90.23%、63.79%、27.01%、44.25%。结
          GAPDH  上游：GGTGAAGGTCGGTGTGAACG             20      果见图2、表2。
                下游：CTCGCTCCTGGAAGATGGTG
          U6    CTCGCTTCGGCAGCACA                    17              过表达组
          2.7 裸鼠肿瘤组织中Wnt7、β-catenin、TCF-4蛋白表达
          水平的检测                                                       模型组
              采用 Western blot 法进行检测。取各组裸鼠肿瘤组
          织各 20 mg，剪碎，加入 250 μL RIPA 裂解液，并加入适                  清热化湿方低剂量组
          量的 PMSF 蛋白酶抑制剂，反复吹打裂解，置于冰上 2 h
          后以 12 000 r/min 离心 10 min；取上清液加入适量蛋白
                                                               清热化湿方中剂量组
          上样缓冲液，沸水加热 5 min 变性，采用 BCA 试剂盒定
          量后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜；以
                                                               清热化湿方高剂量组
          4% 脱脂奶粉封闭 2 h，加入 Wnt（稀释度为 1∶1 000）、
          β-catenin（稀释度为1∶1 000）、TCF-4（稀释度为1∶2 000）、
                                                                      对照组
          GAPDH（稀释度为 1∶1 000）一抗，于 4 ℃孵育过夜；以
          1%TBST洗膜，加入相应二抗室温孵育2 h；以1% TBST                            图2 各组裸鼠肿瘤组织的观察结果
          洗膜后加入适量ECL显色液显影，采用凝胶成像仪曝光
                                                             表2 各组裸鼠肿瘤组织质量和抑制率的测定结果（n＝5）
          成像，并用Image J软件分析图像，以目的蛋白与内参的
                                                              组别                    肿瘤组织质量（x±s）/g  肿瘤抑制率/%
          灰度值比值表示其表达水平。                                       模型组                     1.74±0.56       －
          2.8 统计学方法                                           过表达组                    0.17±0.09 a    90.23
              采用 SPSS 21.0 软件进行统计分析，计量资料采用                    清热化湿方低剂量组               1.73±0.56       0.57
         -                                                    清热化湿方中剂量组               1.27±0.20  a   27.01
          x±s表示。方差齐性时组间比较采用方差分析，不符合                           清热化湿方高剂量组               0.97±0.15  a   44.25
          正态分布的采用秩和检验。检验水准α＝0.05。                             对照组                     0.63±0.17  a   63.79
          3 结果                                                  －：无相应数据；a：与模型组比较，P＜0.05。
          3.1 miRNA-155稳定过表达AGS细胞株的构建情况                      3.3 裸鼠肿瘤组织病理形态学的观察结果
              荧光显微镜下观察细胞荧光及细胞状态发现，在嘌                             模型组裸鼠肿瘤细胞排列紧实，核大且染色较深；
          呤霉素筛选后，细胞初期死亡较多，荧光较弱；随着时间                          与模型组相比，过表达组、对照组及清热化湿方低、中、
          延长，细胞状态好转，荧光增强且能稳定传代，说明                            高剂量组裸鼠的肿瘤细胞均出现不同程度的排列疏松，
          miRNA-155 过 表 达 AGS 细 胞 株 构 建 成 功 。 结 果            核染色较浅，出现坏死灶。其中，过表达组裸鼠肿瘤组
          见图1。                                               织的损伤程度最高，对照组次之；清热化湿方低、中、高


          中国药房  2023年第34卷第19期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 19    · 2341 ·
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