Page 59 - 《中国药房》2023年18期
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2.5.2 平板法评价抑菌能力                                    理论分子量均为1 042.44，C8-K（C8 ）FFHK的理论分子量
              将培养至对数生长期的 MRSA、E. coli 菌株用 PBS                为956.12，与TOF-MS结果相符（图略）。
         （pH6.0）稀释，得到 OD600值为 0.15 的菌液。同时采用倍                 3.2 Fc偶联自组装多肽的稳定性结果
                                                                                                          [16]
          比稀释法配制不同质量浓度（15～800 μg/mL）的多肽溶                         Zeta电位的变化能够验证分散体系的物理稳定性 。
          液，接种于96孔板中，加入180 μL上述菌液及10 μL各                     本研究结果显示，室温下放置24、96 h时，Fc-K（C8 ）FFHK、
          质量浓度的多肽溶液、10 μL H2O2 （10 mg/mL），即得混                C8-K（Fc）FFHK 的紫外吸收图谱几乎没有改变。放
          合物；另取 10 μL PBS 按上述操作后作为对照。各组于                     置 96  h 时 与 放 置 24  h 时 相 比 ，Fc-K（C8）FFHK、
          37 ℃下反应8 h，随后在无菌条件下吸取100 μL，均匀地                    C8-K（Fc）FFHK的Zeta电位分别减少了0.3、0.5 mV，证明
          平铺在LB肉汤琼脂固体培养基上，37 ℃下培养18 h后，                      2 种多肽的稳定性良好，具有作为抗菌肽药物进行研究
          通过菌落的数量来评价多肽的抑菌能力。                                 和应用的基本条件 。
                                                                             [17]
          2.6 Fc偶联自组装多肽的生物相容性评价                              3.3 Fc偶联自组装多肽的二级结构表征结果
          2.6.1 细胞毒性检测                                           CD 图谱特征区可以表明多肽溶液中存在二级结
              使用 CCK-8 法对 3 种多肽的细胞毒性进行评价。                    构，包括β-折叠、α-螺旋、无规卷曲等 。CD图谱结果显
                                                                                            [14]
                         3
          将 HFF-1 按 5×10 个/孔接种在 96 孔板中，在 37 ℃、含              示，Fc-K（C8 ）FFHK和C8-K（Fc）FFHK在208 nm波长处均
          5%CO2的恒温细胞培养箱中培养18 h至细胞贴壁，随后                       有明显的负峰，这表明Fc-K（C8 ）FFHK和C8-K（Fc）FFHK
          将原始细胞培养基替换为添加有不同质量浓度的3种多                           中存在 α-螺旋二级结构，且二者在 225 nm 波长处的正
          肽溶液（25、50、100、200 μg/mL）的新鲜杜氏改良 Eagle
                                                             峰归属于芳香性基团 Fc 的 π-π 共轭；C8-K（C8 ）FFHK 在
          培养基，其中只加入新鲜杜氏改良 Eagle 培养基的作为
                                                             203、222 nm附近波长处均有负峰，这表明C8-K（C8 ）FFHK
          对照，每组设 3 个平行。24 h 后将培养基替换为含有
                                                             中同样存在α-螺旋二级结构，峰位置的微小偏移可能来
          10%CCK-8的新鲜杜氏改良Eagle培养基，孵育2 h，使用
                                                             自Fc或者F氨基酸提供的共轭结构。
          酶标仪于450 nm波长处检测各孔的吸收值，并计算细胞
                                                                 FTIR 图谱能够通过酰胺Ⅰ区和酰胺Ⅱ区的特征峰
          活力：细胞活力（%）＝（测量值－空白值）/（对照值－空
                                                                                               [18]
                                                             形来表明蛋白或肽链二级结构的存在 。本研究结果
          白值）×100%。
                                                             显示，Fc-K（C8 ）FFHK、C8-K（Fc）FFHK和C8-K（C8 ）FFHK
          2.6.2 溶血性检测
                                                                          －1
                                                             均在 1 631 cm 处有明显的特征峰，表明溶液中存在
              将新鲜兔血样品（0.5 mL）与 PBS（1 mL，pH 7.4）混
                                                             β-折叠。ThT 荧光光谱结果显示，在同一波长条件下，
          合，以4 500 r/min离心5 min，分离红细胞，用PBS清洗5
                                                             Fc-K（C8 ）FFHK中β-折叠含量最高。
          次后，再用 PBS 稀释至 5 mL。取 0.3 mL，加入 1.2 mL 3
                                                                 纳米形貌观察结果显示（图2），Fc-K（C8 ）FFHK自组
          种不同质量浓度的多肽溶液（50、100、200 μg/mL），涡旋
                                                             装成带宽为（11±4）nm 的扭曲纳米带，C8-K（Fc）FFHK
          混合均匀，在室温下放置 3 h 后，以 2 500 r/min 离心 3
                                                             组装成直径为（9±2）nm 的短纳米纤维，C8-K（C8 ）FFHK
          min，取上清液。使用酶标仪于540 nm波长处测量上清
          液的吸光度（A）；以去离子水代替多肽溶液作为阳性对                          则组装成直径为（8±2）nm的圆柱状纳米纤维。
                                                                                                 [19]
          照，PBS 代替多肽溶液作为阴性对照，并按下式计算溶                             纳米结构的差异与多肽序列有关 。C8-K（C8 ）
          血 率 ：溶 血 率（%）＝（A 多肽 －APBS ）/（A 去离子水 －APBS ）×       FFHK 是典型的叉指状结构，叉指状结构通常以分级组
          100%。                                              装的方式进行自组装，亲水性的氨基酸围绕疏水中心排
          3 结果与分析                                            布形成胶束，再以分级组装的方式逐步自组装形成圆柱
          3.1 Fc 偶联自组装多肽的制备、纯化及分子量测定                         状纳米纤维。Fc-K（C8 ）FFHK 和 C8-K（Fc）FFHK 纳米形
          结果                                                 态的差异来自 Fc 残基和 C8残基的相对位置差异：当长
              本 研 究 合 成 并 纯 化 得 到 2 种 同 分 异 构 多 肽            烷基链处于多肽主链时，多肽更倾向于聚集形成疏水中
          Fc-K（C8 ）FFHK、C8-K（Fc）FFHK 以 及 对 照 多 肽               心，以“聚集-成核-延长”的过程形成圆柱状纳米结构，但
          C8-K（C8 ）FFHK 3种多肽分子（图1）。3种多肽的纯度均                  是由于Fc的存在，共轭结构之间的π-π电子堆叠作用阻
          大于 95%（图略）；Fc-K（C8 ）FFHK 和 C8-K（Fc）FFHK 的          碍了纳米纤维在纵向上的不断生长，难以延长形成交联










                    A. Fc-K（C 8 ）FFHK                 B. C 8-K（Fc）FFHK                  C. C 8-K（C 8 ）FFHK
                              图1 Fc-K（C8 ）FFHK、C8-K（Fc）FFHK和C8-K（C8 ）FFHK的结构式


          中国药房  2023年第34卷第18期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 18    · 2229 ·
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