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粗产物进行纯化。以0.1%三氟乙酸溶液（A）-0.1%三氟                       2.4 Fc偶联自组装多肽的体外ROS生成效率研究
          乙酸乙腈溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～3 min，                        2.4.1 溶液体系ROS生成效率的测定
          5%B；3～13  min，5%B→30%B；13～26  min，30%B→                 采用亚甲基蓝（methylene blue，MB）褪色反应来表
          60%B；26～28 min，60%B→95%B；28～32 min，95%B→            示 ROS 的生成效率。ROS 的产生使得 MB 在 664 nm 波
          5%B）；流速为10 mL/min；柱温为25 ℃；进样量为5 mL；
                                                              长处吸光度下降。将实验分为Control组、Fc-K（C8 ）FFHK
          收集 22～26 min 的洗脱液。采用 TOF-MS 仪             [14] 测定
                                                              组和 C8-K（Fc）FFHK 组，Control 组加入 H2O2 （1 mg/mL，
          多肽分子量。洗脱液于－65 ℃真空冷冻干燥后得到
                                                              pH6.0）和 MB 溶液（10 mg/L，pH6.0），Fc-K（C8 ）FFHK 组
          Fc-K（C8 ）FFHK、C8-K（Fc）FFHK、C8-K（C8 ）FFHK 3 种多
                                                              和 C8-K（Fc）FFHK 组均在 Control 组的基础上加入“2.2”
          肽的冻干肽粉末。
                                                              项下多肽储备溶液的稀释液（0.1 mg/mL，pH6.0），将各
          2.2 Fc偶联自组装多肽的稳定性检测
                                                              组的水溶液分别等量混合，将混合后的溶液各取2 mL，
              取“2.1”项下3种多肽的冻干肽粉末，用磷酸盐缓冲
          液（PBS，pH7.4）均匀溶解，得质量浓度均为10 mg/mL的                   置于37 ℃摇床，分别在20、40、60、120 min时，采用紫外
          单一溶液，室温下放置24 h待其自组装得到单一多肽储                          可见分光光度计于664 nm波长处检测吸光度。
          备溶液，然后用 PBS（pH6.0）稀释得到质量浓度均为 1                      2.4.2 细胞内ROS生成效率的测定
          mg/mL的单一多肽溶液，分别于室温下放置24、96 h时，                          采用 DCFH-DA 探针检测细胞内的 ROS 生成效率。
          采用紫外可见分光光度计测定多肽溶液的紫外吸收光                             将培养至对数生长期的 E. coli 菌株用不同 pH（pH6.0、
          谱，Zeta电位分析仪测定其Zeta电位，以验证3种多肽的                       pH7.4）的 PBS 稀释，采用紫外可见分光光度计得到在
          稳定性。                                                600 nm 波长处吸光度（简称“OD600”）值为 0.15 的菌液。
          2.3 Fc偶联自组装多肽的二级结构表征                                将实验分为 Control 组（给予 PBS）、H2O2组（给予 PBS 及
              取“2.1”项下3种多肽的冻干肽粉末适量，按“2.2”项
                                                              100 μg/mL H2O2 ）、Fc-K（C8 ）FFHK 组[给予 PBS 及 100
          下方法进行自组装，然后用不同pH的PBS稀释，得到不
                                                              μg/mL Fc-K（C8 ）FFHK]、C8-K（Fc）FFHK 组[给予 PBS 及
          同质量浓度的储备肽液，以进行实验研究。
                                                              100 μg/mL C8-K（Fc）FFHK]、Fc-K（C8 ）FFHK+H2O2组[给
          2.3.1 CD的测定
                                                              予 PBS、100 μg/mL H2O2及 100 μg/mL Fc-K（C8 ）FFHK]、
              在 CD 仪上记录 3 种多肽的 CD 图谱，具体方法如
                                                              C8-K（Fc）FFHK+H2O2 组[给予 PBS、100 μg/mL H2O2 及
          下：在恒定氮气流量下，将上述稀释后的储备肽液（500
                                                              100 μg/mL C8-K（Fc）FFHK]，上述各组分别与 2 种 pH
          μg/mL）放置在光通长度为0.1 cm的矩形石英室中，设置
          CD光谱范围为185～260 nm，狭缝宽度为0.1 nm。每组                   （pH6.0、pH7.4）下培养的 E. coli 菌株共孵育，于 37 ℃恒
          设3个平行，每个样品重复测量3次，取平均值。                              温箱中反应8 h；随后以2 500 r/min离心3 min去除PBS，
          2.3.2 FTIR的测定                                       用生理盐水洗涤菌株 3 遍；加入 500 μL DCFH-DA 生理
              将自组装24 h后的3种多肽进行冷冻干燥得到冻干                        盐水溶液（100 μg/mL）重悬 E. coli 菌株，于 37 ℃下孵育
          肽粉末，并与 KBr 粉末共同碾磨至无明显颗粒后，压成                         30 min，再用生理盐水洗涤菌株 3 遍；最后用 100 μL 生
                                          －1
          片状，使用FTIR仪于1 500～1 700 cm 范围内测量3种                   理盐水重悬 E. coli 菌株，吸取 3 μL 滴加在盖玻片上，置
          多肽的红外吸收情况。                                          于正置荧光显微镜下观察。
          2.3.3 ThT荧光光谱的测定                                    2.5 Fc偶联自组装多肽的抗菌活性评价
              以 ThT 为荧光染料检测 3 种多肽中 β-折叠的含量。
                                                              2.5.1 生长曲线法测定最低抑菌浓度
          将 ThT（0.2 mg/mL）与“2.3”项下储备肽液（2 mg/mL）/
                                                                  将培养至对数生长期的 MRSA、E. coli 菌株用 PBS
          PBS按1∶1（V/V）混合，暗处放置2 h，采用荧光光谱仪进
                                                             （pH6.0）稀释，得到OD600值为0.15的菌液。同时按“2.2”
          行检测，设置激发波长为 450 nm，吸收波长为 470～700
                                                              项下方法配制不同质量浓度（200～16 000 μg/mL）的多
          nm。每组设3个平行。
                                                              肽溶液，接种于96孔板中，每孔加入180 μL上述菌液及
          2.3.4 纳米形貌观察
                                                              10 μL 各质量浓度的多肽溶液、10 μLH2O2 （10 mg/mL），
              采用生物型TEM进行观察。取5 μL稀释后的储备
          肽液（300 μg/mL），沉积在碳涂层铜网格上，用滤纸迅速                      使得 3 种多肽的最终质量浓度为 10～800 μg/mL；另取
          吸取多余的溶液，然后在样品上方滴入 2% 乙酸铀酰水                          10 μL PBS 按上述操作后作为对照，每组设 3 个平行。
          溶液负染色，再用滤纸吸取多余的溶液，将样品置于室                            将 96 孔板置于 37 ℃酶标仪中测量 OD600值。细菌生长
          温下晾干 3 h，最后用生物型 TEM（工作电压 120 kV）对                   活力呈现浓度依赖性下降，当 OD600值不再升高时的最
                                                                                                 [15]
          样品进行亮场透射电镜成像。                                       低质量浓度被认为是最低抑菌浓度（MIC） 。

          · 2228 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 18                            中国药房  2023年第34卷第18期
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