Page 50 - 《中国药房》2023年18期
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gefitinib  had  a  synergistic  inhibitory  effect  on  the  proliferation  of  H1975  cells （CI＜1），  while  there  was  no  synergistic  inhibitory
          effect on H1299 cells （CI＞1）. Compared with the blank group， the apoptosis rate and the proportion of H1975 cells at G0/G1 phase
          were increased significantly in administration groups， while the proportions of cells at S phase and G2/M phase （except for several
          TPL  groups）  were  decreased  significantly，  and  the  combination  group  had  better  effects （P＜0.05）.  Molecular  docking  studies
          showed  that  the  hydroxyl  radical  of  TPL  could  form  hydrogen  bonds  with  the  Thr854  residue  of  the  product  encoded  by  EGFR
          T790M/L858R  mutation.  Compared  with  the  blank  group，  the  expressions  of  pathway-related  proteins  were  down-regulated
          significantly  in  administration  groups，  while  those  of  autophagy-related  proteins  were  up-regulated  significantly，  and  the
          combination  group  had  better  effects （P＜0.05）.  CONCLUSIONS  TPL  combined  with  gefitinib  can  synergically  inhibit  the
          proliferation activity of EGFR-mutated NSCLC cells， the mechanism of which may be related to the down-regulation of PI3K/Akt/
          mTOR pathway and induction of autophagy.
          KEYWORDS     triptolide；  gefitinib；  epidermal  growth  factor  receptor；  tyrosine  kinase  inhibitor；  non-small  cell  lung  cancer；
          phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin pathway； autophagy； drug resistance


              肺癌是癌症致死的首要原因，其中约85%的肺癌为                         1.2 主要药品与试剂
          非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），严重             TPL对照品（批号111567-202005，纯度≥98%）购自
                      [1]
          影响人类健康 。近年来，表皮生长因子受体（epidermal                      中国食品药品检定研究院；吉非替尼片（批号211102，规
          growth factor receptor，EGFR）编码基因分型的鉴定和              格 0.25 g）购自日本 Kagamiishi Plant，Nipro Pharma Cor‐
          EGFR 酪氨酸激酶抑制剂（EGFR tyrosine kinase inhibi‐          poration。TPL 对照品和吉非替尼片均保存于二甲基亚
          tors，EGFR-TKIs）靶向药物的发展，极大地改变了EGFR                   砜（DMSO）中（最终质量浓度均为 100 μg/mL），临用前
                                           [2]
          基因突变晚期NSCLC患者的治疗结局 。然而，几乎所                          以无血清培养基稀释至相应质量浓度。
          有的 EGFR 基因突变阳性患者都会在治疗 1 年内对                             RPMI 1640 培养基购自美国 Gibco 公司；核糖核酸
          EGFR-TKIs 产生获得性耐药 ，故探寻能够预防或克服                       酶Ⅰ购自美国 Sigma-Aldrich 公司；碘化丙啶（propidium
                                   [3]
          EGFR-TKIs 耐药的治疗方案成为该领域的主要研究                         iodide，PI）试剂购自北京百奥莱博科技有限公司；MTT
          方向。                                                 试剂（批号 c7062）购自北京博奥森生物技术有限公司；
              近期研究证实，某些天然药物成分可通过不同的信                          兔 源 PI3K  p85α 单 克 隆 抗 体（批 号 ab191606）、兔 源
                                                 [4]
          号通路来推迟或阻止EGFR-TKIs耐药的发生 。雷公藤                        Akt3+Akt2+Akt1 重组单克隆抗体（批号 ab32505）、小鼠
          甲素（triptolide，TPL）是从中药雷公藤中提取分离的一                    源哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapa‐
          种二萜类化合物，具有显著的抗肿瘤活性，且在逆转化                            mycin，mTOR）单克隆抗体（批号 ab87540）、兔源微管相
          疗药物耐药方面具有一定潜力              [5―6] ，然而其具体机制尚          关蛋白 1 轻链 3α（microtubule-associated protein 1 light
          不清楚。既往有研究证实，TPL可调节多种生物学过程                           chain 3α，MAP1LC3A）单克隆抗体（批号ab52768）、兔源
          关键蛋白的表达，且与磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphati‐                     MAP1LC3B 多 克 隆 抗 体（ 批 号 ab51520）、Alexa
                                                                  ®
          dylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，  Fluor 488 标记的山羊抗兔 IgG 二抗（批号 ab150077）、
                                                                        ®
          又称Akt）通路的关系尤其密切 ；同时，PI3K/Akt通路与                     Alexa  Fluor 488 标 记 的 山 羊 抗 鼠 IgG 二 抗（批 号
                                    [7]
                                       [8]
          EGFR-TKIs 耐药的发生密切相关 。为此，本课题组基                       ab96879）均购自英国Abcam公司。
          于 PI3K/Akt 通路，以耐药细胞为对象，初步探索 TPL 对                   1.3 实验细胞
          第一代 EGFR-TKIs 吉非替尼获得性耐药的抑制作用及                           人 EGFR 低敏感性 NSCLC 细胞系 H1975（即 EGFR
          潜在机制，旨在为进一步阐明 TPL 的药理作用提供参                          T790M/L858R 突变的耐药细胞系）和高敏感性 NSCLC
          考，亦为预防或逆转 EGFR-TKIs 耐药提供候选治疗                        细胞系H1299（即EGFR野生型的非耐药细胞系）均购自
          策略。                                                 日本Riken细胞库。
          1 材料                                                2 方法
          1.1 主要仪器                                            2.1 细胞培养
              本研究所用主要仪器包括 BD Accuri C6 型流式细                       将 H1299 和 H1975 细胞置于含有 10% 胎牛血清、
          胞仪（美国 BD Biosciences 公司）、XBQ-2H 型细胞培养               L-谷氨酰胺（2 mmol/L）、1% 青霉素-链霉素双抗和 25
          仪（上海佐研仪器科技有限公司）、LD-96A型酶标仪（山                        mmol/L  HEPES 缓 冲 液 的 RPMI  1640 培 养 基 中 ，在
          东莱恩德智能科技有限公司）等。                                     37 ℃、5%CO2条件下培养。待细胞生长融合度达 90%


          · 2220 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 18                            中国药房  2023年第34卷第18期
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