Page 51 - 《中国药房》2023年18期
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时，用0.25%胰酶消化并按照1∶3的比例传代继续培养，                       白组不作处理。培养24、48 h后，收集各组细胞，并固定
          取传至第2代的细胞进行后续实验。                                   于冷的 75% 乙醇中，随后用含 200 mmol/L Na2PO4 和
          2.2 TPL、吉非替尼单用及两药联合对2种细胞敏感性                        0.1%Triton X-100 试剂的 DNA 缓冲液处理，再以含 200
          影响的检测                                              μg/mL核糖核酸酶Ⅰ的PI试剂染色，使用流式细胞仪检
              待H1299和H1975细胞铺满培养皿60%左右时，取                    测各组细胞的凋亡率及周期分布情况。
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          生长良好的细胞以 2.5×10 个/孔接种于 6 孔板中，在                     2.4 TPL与EGFR分子对接分析
          37 ℃、5%CO2条件下培养（培养条件下同）。待细胞完                           从 PDB 蛋白质数据库（https：//www.rcsb.org/）加载
          全贴壁后，分为空白组（仅含细胞和培养液）、不同浓度                          EGFR T790M/L858R 突变型及野生型编码产物的晶体
                                                      [6]
          TPL组（1、5、10、15、20、25、30 nmol/L，参考相关文献 和            结构，去除水分子后，基于 AMBER99 力场对其进行质
          预实验结果设置）、不同浓度吉非替尼组（1、2、4、8、12、                     子化处理；利用 MMFF94s 力场优化 TPL 的分子结构。
          16、20 µmol/L，参考相关文献 和预实验结果设置）、不                    利用 MOE 分子对接软件模拟 TPL 和 EGFR 的结合位
                                   [7]
          同浓度 TPL+吉非替尼组（5 nmol/L TPL 分别联合 2、5、               点。基于结合对接能量对 TPL 的所有结合位点进行排
          10、20 µmol/L 吉非替尼，10 nmol/L TPL 分别联合 2、5、          序，并选择能量最低的构象进行结合模式展示。
          10、20 µmol/L吉非替尼，参考前期MTT筛选结果设置），                   2.5  TPL 联 合 吉 非 替 尼 对 H1975 细 胞 PI3K/Akt/

          每组设6个复孔。弃去培养液，各药物组加入相应药液，                          mTOR通路及自噬相关蛋白表达影响的检测
          空白组不作处理。培养 24、48、72 h 后，收集各组细胞，                        采用流式细胞术检测。取生长良好的 H1975 细胞
                                                                    5
          加入 5 mg/mL MTT 试剂 20 μL，在 37 ℃下孵育 4 h，使            以2×10 个/孔接种于6孔板中，培养，待细胞贴壁后，按
          用酶标仪于 490 nm 波长处检测各孔的光密度（optical                  “2.3”项下方法分组、干预。培养24、48 h后，收集各组细
          density，OD）值并计算细胞存活率：细胞存活率（%）＝药                    胞，分别用核因子固定液和渗透缓冲液固定和渗透，然
          物组OD值/空白组OD值×100%。计算吉非替尼（作用                        后加入 PI3K、Akt、mTOR、MAP1LC3A、MAP1LC3B 一
          24、48、72 h）的半数抑制浓度（IC50 ）和吉非替尼单用及两                 抗（稀释比例均为 1∶2 000），4 ℃孵育过夜；再加入相应
          药联用（作用48 h）的药物敏感度指数（sensitivity index，             二抗（稀释比例均为 1∶1 000），孵育 1 h。使用酶标仪检
          SI）：SI＝∆X/∆Y（式中，∆X是细胞存活数，∆Y是正常细胞                   测并使用 FlowJo V10 软件分析目的蛋白的荧光强度以
          总数）。若 SI＝1.0，表示细胞对药物的敏感性不明显；                       表示其表达水平。
          SI＞1.0，表示细胞对药物的敏感性较高；SI＜1.0，表示细                    2.6 统计学方法
                                [9]
          胞对药物的敏感性较低 。采用中位药效法（Chou-                              采用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。数据均
          Talalay法）计算TPL联合吉非替尼作用48 h的联合用药                    以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两
                                                             两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
          指数（combination index，CI）：CI＝d1/D1+d2/D2 （式中，d1
                                                             3 结果
          和d2分别为联合用药时吉非替尼和TPL的浓度；D1和D2
          分别为产生与联合用药相等效应时吉非替尼和 TPL 单                         3.1 TPL、吉非替尼单用及两药联合对2种细胞敏感性
          用的浓度）。CI＞1为两药拮抗，CI＝1为两药相加，CI＜                      的影响
                     [6]
          1 为两药协同 ；以受影响的细胞比例（Fa）为横坐标、CI                          随着浓度的增加和时间的延长，TPL、吉非替尼对
          为纵坐标绘制散点图，若 Fa 为 0.2～0.8 则表示药物                     H1975 和 H1299 细胞增殖的抑制作用逐渐增强，且具有
              [7]
          有效 。                                               浓度、时间依赖趋势（图 1A、1B）。作用 24、48、78 h 时，
          2.3 TPL 联合吉非替尼对 H1975 细胞凋亡及周期分布                    吉非替尼对 H1975 细胞的 IC50分别为 15.10、11.67、7.31
          影响的检测                                              μmol/L，对 H1299 细胞的 IC50 分别为 15.78、12.75、9.48
              取生长良好的 H1975 细胞以 2×10 个/孔接种于 6                 μmol/L。作用 48 h 时，吉非替尼对 H1975 细胞的 SI 为
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          孔板中，培养，待细胞贴壁后，分为空白组（仅含细胞和                          0.73；与 5 或 15 nmol/L 的 TPL 联用后，SI 分别升至 1.88、
          培养液），低、高浓度 TPL 组（5、15 nmol/L，参考“2.2”项              2.30，提示联用后药物对H1975细胞的敏感性有所增加；
          下结果设置），吉非替尼组（2 μmol/L，参考“2.2”项下结                   此外，两药联合作用 48 h 对 H1975 细胞的 CI 均小于 1
          果设置），低浓度TPL+吉非替尼组、高浓度TPL+吉非替                      （Fa 约为 0.5），提示两药联合对 H1975 细胞的增殖具有
          尼 组（5  nmol/L  TPL+2  μmol/L 吉 非 替 尼 ，15  nmol/L   协同抑制效应。但两药联用对 H1299 细胞的 CI 均大于
          TPL+2 μmol/L 吉非替尼，参考“2.2”项下结果设置），每                 1（Fa多低于0.2），提示两药联合对H1299细胞的增殖并
          组设6个复孔。弃去培养液，各药物组加入相应药液，空                          无上述协同抑制效应（图1C、图1D）。


          中国药房  2023年第34卷第18期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 18    · 2221 ·
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