Page 23 - 《中国药房》2023年16期

downstream inflammatory factors in microglia， and reduced the apoptosis of neurons in the co-culture system of primary neurons
and primary microglia （P＜0.05）. CONCLUSIONS CA can exert a protective effect on the brain， which may be related to
relieving the secondary acute inflammatory injury after intracerebral hemorrhage by inhibiting TLR4-mediated inflammatory response.
KEYWORDS calycosin； intracerebral hemorrhage； secondary acute inflammatory injury； Toll-like receptor 4； microglia

脑出血是指非外伤导致的脑实质内血管破裂出血， molecule 1，Iba1）多克隆抗体（货号019-19741）购自日本
具有高发病率、高致残率和高病死率等特点 。在脑出 WAKO公司；兔源TLR4、白细胞介素1β（interleukin-1β，
[1]
血的急性期，过度的炎症反应会导致小胶质细胞过度活 IL-1β）、神经元特异性核蛋白（neuron specific nuclear
化，进而产生大量毒性促炎因子，破坏血脑屏障并加剧 protein，NeuN）多 克 隆 抗 体（货 号 分 别 为 ab13556、
脑水肿，最终导致神经元凋亡 [2―3] 。因此，抑制脑出血后 ab1234437、ab104225）均购自英国 Abcam 公司；兔源肿
急性期过度的炎症反应可能是治疗脑出血的有效途 瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、诱导型
[4]
径 。脑出血后的炎症损伤机制十分复杂，涉及多个分 一氧化氮合酶（inducible nitric-oxide synthase，iNOS）多
子和信号通路。其中，Toll样受体4（Toll-like receptor 4， 克隆抗体和 Alexa Fluor 555 标记的驴抗兔 IgG 二抗（货
TLR4）是一种保守的天然免疫受体，在脑出血后的炎症 号分别为 11948S、13120S、4413）均购自美国 Cell Signa-
反应中具有重要作用，其表达下调与抑制脑出血后炎症 ling Technology 公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗
反应有关，是治疗脑出血的有效手段 [5―6] 。毛蕊异黄酮 小鼠 IgG 二抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG
（calycosin，CA）是从中药材黄芪中提取的黄酮类成分， 二抗（货号分别为 115-035-146、111-035-003）均购自美
具有抗炎、抗氧化作用，对受损脑组织具有保护的作 国 Jackson ImmunoResearch 公司；4′，6-二脒基-2 苯基吲
用 [7―8] 。基于此，本研究通过构建脑出血小鼠模型，初步 哚（DAPI）、RIPA裂解和提取缓冲液（货号分别为62248、
探讨 CA 对脑出血的改善作用，并通过体外培养原代小 89900）均购自美国Thermo Fisher Scientific公司。
胶质细胞和原代神经元进一步探讨该成分是否能通过 1.3 实验动物
抑制 TLR4 表达而减轻脑出血后继发的急性炎症损伤， SPF级C57BL/6小鼠（雄性，体重22～25 g，8～10周
为进一步开发CA用于临床治疗脑出血提供实验基础。 龄）、孕小鼠（体重 40～48 g，8 周龄，其出生 1～3 d 的乳
1 材料 鼠用于提取原代小胶质细胞）均购自广东省医学实验动

1.1 主要仪器 物中心，动物生产许可证号为SCXK（粤）2018-0002。所
68025型脑立体定位仪购自深圳市瑞沃德生命科技 有动物均饲养于广州医科大学附属第二医院实验动物
有限公司；2406-2 型细胞 CO2培养箱购自美国 Thermo 中心（环境温度 20～26 ℃，相对湿度 40%～70%，12 h/
Fisher Scientific公司；LX71型荧光倒置显微镜购自日本 12 h明暗交替），自由摄食、饮水。本实验方案经广州医
Olympus 公司；LB 942 型多功能酶标仪购自德国 Ber‐ 科大学附属第二医院动物伦理委员会审查批准（审查编
thold Technologies 公 司 ；Transwell 板（12 孔 ，孔 径 0.4 号A2021-006）。
μm）购自美国Corning公司；ChemiScope 6100型荧光及 2 方法
化学发光成像系统购自上海勤翔科学仪器有限公司。 2.1 CA药液的配制
1.2 主要药品与试剂 取CA对照品适量，溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配
CA 对照品（货号 WXHY-000687，纯度＞98%）购自 制成CA储备液。取上述CA储备液适量，用9倍体积的
天津万象恒远科技有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS）、牛血 PBS 稀释至 DMSO 含量为 1%。根据实验需要，再用
清白蛋白（BSA）、Ⅶ型胶原酶（货号分别为 E607008、 PBS或培养基稀释成所需的浓度。
A600332、A005332）均购自生工生物工程（上海）股份有 2.2 体内动物实验
限公司；DMEM 高糖培养基、胎牛血清（FBS）、B27 添加 2.2.1 小鼠分组、脑出血模型的构建和给药
剂、Neurobasal培养基（货号分别为11995040、10099141、 将雄性小鼠随机分为假手术组、模型组和不同剂量
[9]
17504044、21103049）均购自美国 Gibco 公司；一步法 CA组。脑出血模型的制备参考文献方法 ：将小鼠用异
TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒、Triton X-100 试剂、鼠源 氟醚麻醉后固定于脑立体定位仪（脑立体定位仪坐标为
β-actin 单克隆抗体、红细胞（RBC）裂解液（货号分别为 前囟右侧 2.0 mm，前囟前 0.5 mm，腹侧 2.8 mm）上，将
C1088、P0096、AA128、C3702）均购自上海碧云天生物 0.2 U的Ⅶ型胶原酶（0.5 μL）缓慢注射到右侧基底节区，
技术有限公司；ACCUTASE 细胞消化液、多聚甲醛（货 注射时间为 1 min；假手术组小鼠同法注射 PBS（0.5
号分别为A6964、P6148）均购自美国Sigma公司；兔源离 μL）。注射后，针头于注射部位保持5 min后拔出，用骨
子 钙 结 合 衔 接 分 子 1（ionized calcium-binding adaptor 蜡密封，再用丝线缝合。上述过程中，小鼠体温应维持

中国药房 2023年第34卷第16期 China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 16 · 1937 ·