Page 24 - 《中国药房》2023年16期
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在37 ℃左右，并于术后自由摄食、饮水。以小鼠苏醒后                          2.2.6 小鼠脑组织中TLR4及其下游炎症因子蛋白表达
          行为和功能异常，且改良神经功能缺损程度（modified                        的检测
          neurological severity score，mNSS）评分明显下降为造模              采用蛋白质印迹法进行检测。取假手术组、模型组
          成功 。在诱导脑出血20 min后，假手术组和模型组小                         和 30、60 mg/kg CA 组小鼠各 4 只（第 2 批编号第 4～7
              [10]
          鼠一次性腹膜内注射 PBS，不同剂量 CA 组小鼠分别一                        只），于手术 72 h 后处死，取出脑组织，除假手术组选择
          次性注射相应剂量的药物（根据前期预实验设置给药剂                            小鼠大脑右侧基底节区的脑组织外，其余各组选择小鼠
          量分别为15、30、60、120 mg/kg）。小鼠脑出血造模实验                   脑出血病变及周边区域脑组织（包括脑出血损伤周围 1
          平行 2 批进行，每批每组 12 只（其中 2～3 只备用）：第 1                  mm区域），用RIPA裂解，收集蛋白样品；以BCA法测定
          批小鼠用于mNSS评分、脑出血体积计算和脑含水量测                           蛋白浓度后，于 100 ℃变性 5 min；取变性蛋白样品（30
          量实验，第2批小鼠用于其余实验。                                    μg）进行 10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分
          2.2.2 小鼠mNSS评分的测定                                   离，并转移到聚偏二氟乙烯膜上，用含 5%BSA 的 1×
              取假手术组、模型组和 15、30、60、120 mg/kg CA 组              TBST 缓冲液于室温下封闭 1 h；加入 TLR4、TNF-α、
          小鼠各8只（第1批编号前8只），分别于手术24、48、72 h                     iNOS、IL-1β、β-actin 一抗（稀释比例均为 1∶1 000），于
          后对其进行 mNSS 评分。mNSS 评分由运动实验，感觉                       4 ℃下孵育过夜；加入相应 IgG 二抗（稀释比例均为
          实验，反射丧失和不正常运动，以及癫病、肌阵挛、肌张                           1∶10 000），孵育 1 h；以 ECL 试剂显色后，使用荧光及化
          力障碍4个部分组成，4个部分得分相加即为总分（最高                           学发光成像系统成像。采用Image J软件分析蛋白条带
                                            [10]
          18分），总分越高则神经功能缺损越严重 。                               灰度值，计算目标蛋白与内参蛋白（β-actin）的条带灰度
          2.2.3 小鼠脑出血体积的计算                                    值比值，再以假手术组为标准作归一化处理，即得目标
              取假手术组、模型组和30、60 mg/kg CA组（CA组剂                  蛋白的相对表达水平。
          量参考“2.2.2”项下结果设置，下同）小鼠各 4 只（第 1 批                   2.2.7 小鼠脑组织中凋亡细胞阳性率的检测
          编号前4只），于手术72 h后处死，取出脑组织，用PBS稀                           采用凋亡染色法进行检测。取假手术组、模型组和
          释的 4% 多聚甲醛固定后，制备连续脑切片（厚度约 1                         30、60 mg/kg CA 组小鼠各 3 只（第 2 批编号第 8～10
          mm）并进行数字摄影，使用 Image-Pro Plus（Media Cy‐              只），于手术 72 h 后处死，取出脑组织并制作脑冰冻切
          bernetics）软件计算脑出血体积：脑出血体积＝每个切片                      片。将上述切片放至湿盒中复温后，用PBS洗涤2次，再
          血凝块面积×切片厚度。                                         用 4% 多聚甲醛固定 30 min；用 PBS 洗涤 2 次，加入 PBS
          2.2.4 小鼠脑含水量的测定                                     稀释的 0.5%Triton X-100 试剂，于室温下孵育 5 min；用
              取假手术组、模型组和 30、60 mg/kg CA 组小鼠各 5                PBS 洗涤 2 次，加入 TUNEL 检测液，于 37 ℃下孵育 60
          只（第 1 批编号第 5～9 只），于手术 72 h 后处死，迅速取                  min；用 DAPI 室温避光孵育 5 min；用 PBS 洗涤 4 次，滴
          出脑组织并称重，得湿重；随后，将脑组织于160 ℃下干                         加含荧光淬灭剂的封片剂后封片，使用显微镜观察。除
          燥 24 h，再次称重，得干重，按下式计算脑含水量：脑含                        假手术组选择小鼠大脑右侧基底节区的脑组织外，其余
          水量（%）＝（湿重－干重）/湿重×100%。                              各组随机选取每张切片脑出血病变及周边区域（包括脑
          2.2.5 小鼠脑组织中Iba1蛋白表达阳性率的检测                          出血损伤周围 1 mm 区域）5 个不重叠的高倍（×200）视
              采用免疫荧光染色法进行检测。取假手术组、模型                          野拍摄，计算每个视野中被染成绿色的细胞数与被染成
          组和 30、60 mg/kg CA 组小鼠各 3 只（第 2 批编号前 3               蓝色的有核细胞数的比值，其平均值即为凋亡细胞阳性
          只），于手术72 h后处死，取出脑组织，经固定、脱水后切                        率，以该阳性率表示细胞的凋亡程度。
          片（厚度约 15 μm）。上述切片用 PBS 稀释的 3%Triton                 2.3 体外细胞验证实验
          X-100试剂在室温下孵育15 min，洗涤后再用PBS稀释的                     2.3.1 原代小胶质细胞中TLR4及其下游炎症因子蛋白
          5%BSA封闭1 h；加入Iba1一抗（稀释比例为1∶1 000），于                 表达的检测
          4 ℃下孵育过夜；加入 Alexa Fluor 555 标记的 IgG 二抗                  取刚出生1～3 d的C57BL/6乳鼠，分离出其大脑皮
         （稀释比例为1∶ 1 000），在室温下孵育2 h；用PBS洗涤3                    层。将皮层组织在含有20%FBS和1%青-链霉素双抗的
          次，用 DAPI 复染细胞核 10 min，封片后使用显微镜观                     DMEM高糖培养基中剪碎，用含有100 U/mL DNA酶Ⅰ
          察。除假手术组选择小鼠大脑右侧基底节区的脑组织                             的 ACCUTASE 细胞消化液消化并重悬后，将所得细胞
          外，其余各组随机选择每张切片脑出血病变及周边区域                            接种到聚-D-赖氨酸包被的培养瓶中，于 37 ℃、5%CO2
         （包括脑出血损伤周围1 mm区域）5个不重叠的高倍（×                          条件下培养7 d；分离杂质并更换培养基，继续培养10～
          200）视野拍摄，计算每个视野中被染成红色的细胞数与                          14 d，收集小胶质细胞。将小胶质细胞以每孔100 000个
          被染成蓝色的有核细胞数的比值，其平均值即为Iba1蛋                          接种于 6 孔板中，分为对照组、RBC 组和 20、40 μmol/L
          白的表达阳性率，以该表达阳性率表示小胶质细胞的激                            CA组（根据前期预实验结果设置药物浓度）。RBC组细
          活程度。                                                胞加入1 μg/mL的RBC裂解液以模拟体内脑出血状态，


          · 1938 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 16                            中国药房  2023年第34卷第16期
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