Page 26 - 《中国药房》2023年15期
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拍照。以神经元 TH 染色阳性且 DAPI 细胞核染色阳性                       表1 各组小鼠的爬杆时间和线悬挂评分测定结果（x±
          为标准，判断为阳性神经元。使用 Image J 1.8.0 软件对                        s，n＝12）
          阳性神经元进行标记计数。                                        组别              爬杆时间/s             线悬挂评分/分
          2.6 小鼠血清与脑黑质中炎症因子水平检测                                        造模前1 d  造模第5天  给药第7天  造模前1 d  造模第5天 给药第7天
                                                              正常组      6.96±1.49  6.60±1.13  6.77±1.15  2.95±0.13  2.83±0.39  2.72±0.34
              采用 ELISA 法进行检测。每组随机取 6 只小鼠的                     模型组      7.34±1.14  23.35±6.61 a  18.95±5.79 a  2.97±0.10  1.67±0.64 a  1.50±0.73 a
          脑黑质制成组织匀浆，并取冻存的小鼠血清常规解冻                             左旋多巴片组   7.79±1.11  23.84±5.57 a  13.39±3.71 b  2.89±0.30  1.61±0.69 a  2.36±0.80 b
                                                              胆南星低剂量组  7.86±1.43  24.38±5.22 a  13.14±3.90 c  2.95±0.13  1.69±0.67 a  1.97±0.83
          后，按照相应 ELISA 试剂盒说明书操作，检测小鼠血清                        胆南星高剂量组  7.94±1.71  22.57±5.68 a  10.88±6.32 c  2.92±0.29  1.56±0.73 a  2.53±0.54 c
          中IL-1β、TNF-α水平与脑黑质中IL-1β、TNF-α、COX-2、                  a：与正常组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与模型组
          iNOS水平。                                             比较，P＜0.01。
          2.7 小鼠脑黑质中 GPX4、FTH1、PKA C-α 蛋白表达                   小鼠脑黑质致密部 TH 阳性神经元数量[分别为（80±
          检测                                                  5）、（76±8）个]差异无统计学意义（P＞0.05），而胆南星
              每组（除左旋多巴片组外）取3只小鼠的脑黑质组织                         高 剂 量 组 小 鼠 脑 黑 质 致 密 部 TH 阳 性 神 经 元 数 量
          样本，采用 Western blot 法进行检测。采用 RIPA 裂解液
                                                              [ （124±7）个]显著增加（P＜0.01）。各组小鼠脑黑质致
          提取组织中总蛋白，按照 BCA 蛋白定量试剂盒方法检
                                                              密部TH阳性神经元的免疫荧光染色图见图1。
          测总蛋白浓度。将总蛋白变性后使用 12% 十二烷基硫
                                                              3.3 小鼠血清及脑黑质中炎症因子水平测定结果
          酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳（电压 80～110 V，时间
                                                                  与正常组比较，模型组小鼠血清中IL-1β、TNF-α水
          1.5 h），然后在恒流（320 mA）下电转3 h至聚偏二氟乙烯
                                                              平和脑黑质中 IL-1β、TNF-α、iNOS、COX-2 水平均显著
         （PVDF）膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h；以TBST洗膜3次，
                                                              升高（P＜0.01）。与模型组比较，各给药组小鼠血清中
          加入GPX4、FTH1、PKA C-α一抗（稀释比例均为1∶1 000）
                                                              IL-1β水平和脑黑质中TNF-α、iNOS和COX-2水平均显
          和 β-tubulin 一抗（稀释比例为 1∶2 000），4 ℃孵育过夜；
                                                              著降低（P＜0.01）；胆南星低、高剂量组小鼠血清中TNF-
          以 TBST 洗涤 3 次，加入 HRP 标记的山羊抗兔 IgG H&L
                                                              α 水平及脑黑质中 IL-1β 水平均显著降低（P＜0.05 或
          二抗（稀释比例 1∶2 000），室温孵育 1 h；以 TBST 洗涤，
                                                              P＜0.01）。结果见表2。
          加入 ECL 显影液，使用超敏多功能成像仪拍照记录，使
                                                              3.4 小鼠脑黑质中GPX4、FTH1、PKA C-α蛋白表达测
          用Image J 1.8.0软件进行灰度值的分析对比。以目的蛋
                                                              定结果
          白与内参蛋白（β-tubulin）条带灰度值的比值表示目的蛋
                                                                  与正常组比较，模型组小鼠脑黑质中 GPX4、FTH1
          白的表达水平。
                                                              和 PKA C-α 蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05 或 P＜
          2.8 统计学方法
                                                              0.01）。与模型组比较，胆南星低剂量组小鼠脑黑质中上
              采用 Graphpad Prism 7.0 软件进行统计分析。实验
                                                              述蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），而胆南
          数据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组
                                                              星高剂量组小鼠脑黑质中上述蛋白表达水平显著升高
          间两两比较使用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
                                                             （P＜0.01）。结果见图2、表3。
          3 结果
                                                              4 讨论
          3.1 胆南星对PD模型小鼠行为学的影响结果
              腹腔注射MPTP后，小鼠表现出现竖毛、弓背、尾巴                            PD患者的经典临床症状为静息性震颤、肌僵直、行
          僵直、短暂的震颤等帕金森类行为改变。造模第5天时，                           动迟缓等，而 PD 的病理特征为黑质多巴胺能神经元的
                                                                                    [1]
          与正常组比较，其余各组小鼠的爬杆时间均显著延长、                            丢失及路易小体的形成 。本研究结果显示，经过
          线悬挂评分均显著降低（P＜0.01），说明造模后小鼠运                         MPTP造模的小鼠基本出现了短暂震颤、竖毛、行动能力
          动能力降低。给药第7天时，与正常组比较，模型组小鼠                           下降、后肢无力以及尾巴僵直的现象，这些现象可在注
          爬杆时间显著延长、线悬挂评分显著降低（P＜0.01）；与                        射 MPTP 3～6 h 后恢复正常；而与正常组相比，模型组
          模型组比较，各给药组小鼠的爬杆时间均显著缩短（P＜                           小鼠脑黑质致密部 TH 阳性神经元数量显著减少，这说
          0.05或P＜0.01），左旋多巴片组和胆南星高剂量组小鼠                       明 MPTP 诱导了多巴胺能神经元的死亡。行为学测试
          的线悬挂评分均显著升高（P＜0.05 或 P＜0.01）。结果                     结果表明，造模后小鼠的运动能力也明显下降，说明PD
          见表1。                                                亚急性小鼠模型成功建立。与模型组相比，高剂量胆南
          3.2 小鼠脑黑质致密部TH阳性神经元数量检测结果                           星能够发挥神经保护作用，该组小鼠 TH 阳性神经元数
              与正常组[（128±10）个]比较，模型组小鼠脑黑质致                     量显著增加，且该组小鼠的行为能力也显著提高，说明
          密部 TH 阳性神经元数量[（75±12）个]显著减少（P＜                      高剂量胆南星对MPTP诱导的PD亚急性模型小鼠具有
          0.01）。与模型组比较，左旋多巴片组和胆南星低剂量组                         改善作用。


          · 1812 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 15                            中国药房  2023年第34卷第15期
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