Page 31 - 《中国药房》2023年15期
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的贮备液。分别精密量取 0.1 mL 上述各成分贮备液置                       分别计算各待测成分与内标的峰面积比值，并代入其当
          于同一 10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成混                       日随行的标准曲线，获得 QC 样品的测定质量浓度。根
          合标准溶液贮备液，然后用倍比稀释法制成系列浓度的                           据各QC样品的理论质量浓度与实测质量浓度计算该方
          混合标准溶液。                                            法的日内精密度[以相对标准偏差（RSD）表示]和准确度
          2.3.2 内标溶液的配制                                      [以相对误差（RE）表示]。经过 3 d 的重复操作，计算各
              精密称取内标磺胺甲噁唑适量，加甲醇溶解制成质                         待测成分的日间RSD和RE。结果见表2。由表2可知，
          量浓度为0.10 mg/mL的贮备液，临用前用甲醇稀释成质                      5 种待测成分的日内、日间 RSD 均低于 15.0%，RE 为
          量浓度为1.0 μg/mL的内标溶液。                                －8.40%～8.94%，符合 2020 年版《中国药典》（四部）对
          2.4 血浆样品预处理                                        生物样品分析的要求。
              取血浆样品100 μL，加入内标溶液10 μL，再加入乙                   2.5.4 基质效应与提取回收率考察
          腈300 μL，涡旋1 min使蛋白充分沉淀后以12 000 r/min                   分别取6只大鼠的空白血浆各3份，每份100 μL，向
          离心 10 min，定量吸取上清液 250 μL 至另一干净试管                   上述每份空白血浆中依次加入甲醇10 μL、乙腈300 μL，
          中，在氮气流下吹干后加入50 μL甲醇复溶，再以12 000
                                                             然后按“2.4”项下方法进行操作，直至氮气流吹干；向同
          r/min离心10 min，取上清液进行分析。
                                                             一只大鼠的3份样品中分别加入低、中、高质量浓度的混
          2.5 方法学验证
                                                             合标准溶液 20 μL 和内标溶液 10 μL，再次以氮气流吹
          2.5.1 专属性考察
                                                             干后，加入 80% 甲醇 50 μL，涡旋复溶后依法进行分析，
              取6只大鼠，分别采集空白血浆，进行等量混合后制
                                                             计算各待测成分与内标的峰面积比值（A）。另取100 μL
          成混合空白血浆。取上述混合空白血浆按“2.4”项下方
                                                             水代替空白血浆按上述方法依法分析，得各待测成分与
          法进行样品处理（内标溶液用甲醇替代）后进样测定，得
                                                             内标的峰面积比值（B）。另取各大鼠的空白血浆 3 份，
          空白血浆样品色谱图 2A；取上述混合空白血浆加入各
                                                             按“2.5.2”项下方法制备低、中、高质量浓度的 QC 样品，
          待测成分混合标准溶液，制备得到质量浓度为定量下限
                                                             按“2.4”项下方法操作，计算各待测成分与内标的峰面积
          的标准血浆样品，按照上述方法处理后进样测定，得到
                                                             比值（C）。以A/B计算得经内标归一化基质因子，以C/A
          色谱图2B；取大鼠灌胃给予齿痛消炎灵颗粒后4 h的血
                                                             计算得提取回收率。结果显示，5 种待测成分在不同大
          浆样品，按照上述方法处理后进样测定，得到色谱图2C。
                                                             鼠空白血浆中的经内标归一化基质因子在（71.57±
          结果显示，芍药苷、橙皮苷、柚皮素、芒柄花素、甘草次
                                                             7.39）%～（100.92±0.28）%，RSD≤13.36%（n＝6），说明
          酸、磺胺甲噁唑的保留时间分别为 4.64、6.43、14.20、
                                                             基质效应对测定结果没有影响；5 种待测成分在低、中、
          9.73、13.89、7.50 min，且血浆中的内源性化学物质对各
                                                             高质量浓度下的平均提取回收率在（72.75±5.48）%～
          待测物测定没有影响。
                                                            （93.54±0.48）%，RSD≤14.74%（n＝6），符合2020年版《中
          2.5.2 标准曲线与定量下限
                                                             国药典》（四部）对生物样品分析的要求。结果见表3。
              取各待测成分系列浓度的混合标准溶液各 20 μL，
                                                             2.5.5 残留效应考察
          用氮气流吹干，然后依次加入大鼠空白血浆 100 μL，并
                                                                 将空白血浆与特定浓度的各待测成分混合，制备浓
          进行涡旋混合，获得系列浓度的标准血浆样品。每个浓
          度点均采取双样本分析以减少测定误差，具体按照“2.4”                        度高达定量上限的标准血浆样品，按 2020 年版《中国药
          项下方法进行样品处理后进样测定。以信噪比 10∶1 时                        典》（四部）“9012生物样品定量分析方法验证指导原则”
          标准血浆样品的最低浓度作为定量下限。以标准血浆                            项下方法进行残留验证。结果显示，空白血浆样品色谱
          样品中各待测物的质量浓度为横坐标（X），待测成分与                          图上没有出现任何与待测成分相关的色谱峰，说明未产
          内标的峰面积比值为纵坐标（Y），采用加权后的最小二                          生残留效应。
          乘法进行线性回归，结果见表1。                                    2.5.6 稳定性考察
          2.5.3 准确度与精密度考察                                        按“2.5.2”方法制备低、中、高质量浓度的 QC 样品，
              按“2.5.2”项下方法制备定量下限及低、中、高3个质                    分别考察其经过 3 次反复冻融（－80 ℃～20 ℃）、在
          量浓度（芍药苷为1.12、3.36、56.00、84.00 ng/mL；橙皮苷            －80 ℃贮存 15 d 和室温贮存 4 h 等不同贮藏条件下放
          为2.12、6.36、212.00、318.00 ng/mL；柚皮素为0.36、1.08、      置后的稳定性；将 QC 样品按“2.4”项下方法处理后，在
          180.60、270.98 ng/mL；芒柄花素为1.23、3.69、61.50、92.25     自动进样器中放置12 h，考察样品处理后的稳定性。结
          ng/mL；甘草次酸为 1.06、3.16、105.50、158.25 ng/mL）的        果显示，低、中、高质量浓度的 QC 样品在上述条件下稳
          质控（QC）血浆样品，每个质量浓度各 6 份，依法测定并                       定性良好，RE均在±15%以内。


          中国药房  2023年第34卷第15期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 15    · 1817 ·
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