Page 25 - 《中国药房》2023年15期
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限公司；兔抗酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）多             溶液[10 g/（kg·d）]，其余各组小鼠灌胃相应药液，每天 1
          克隆抗体、Alexa Fluor  488标记的山羊抗兔免疫球蛋白                  次，连续7 d。每天称定各组小鼠的体重。
                            ®
          G（IgG）H&L 二抗和含 DAPI 的水基封固剂均购于美国                    2.3 小鼠行为学检测
          Abcam公司，货号分别为ab6211、ab150077和ab104139；             2.3.1 爬杆测试
          小鼠的 IL-1β、TNF-α、COX-2、iNOS 酶联免疫吸附测定                    爬杆测试用于检测小鼠的运动能力。造模前 1 d、
         （ELISA）试剂盒均购于泉州睿信生物科技有限公司，货                         造模第 5 天以及末次给药后进行爬杆测试。取一根长
          号 分 别 为 RX203063M、RX202412M、RX200401M、             55 cm、宽 0.8 cm 的竖杆，外周缠绕 1 层纱布防止小鼠打
          RX201999M；兔 PKA C-α 一抗、兔 GPX4 一抗、兔 FTH1            滑，在杆的一端固定 1 个直径约 2 cm 的小球，另一端与
          一抗、兔 β-微管蛋白（β-tubulin）一抗、辣根过氧化物酶                   地面垂直并固定在平台上。每次将1只小鼠从饲养笼转
         （HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗均购于艾比玛特医药科                         移至中转笼，待小鼠状态稳定后，将小鼠头朝下放置在
          技（上 海）有 限 公 司 ，货 号 分 别 为 MA8076、T56959、            球的顶端，记录小鼠开始向下爬行至双后肢触碰平台的
          T55648、PA4302、M21002；BCA 蛋白定量试剂盒、超敏                时间，即爬杆时间。小鼠中途停顿或者逆向爬行则视为
          ECL发光液均购于大连美仑生物技术有限公司，货号分                          爬行无效，需重新测量；爬杆时间超过 30 s 的仍记为 30
                                                              [15]
          别为MA0082、MA0186。                                   s 。重复实验3次，每次实验间隔5 min。
          1.3 动物                                             2.3.2 线悬挂测试
              本研究所用动物为 SPF 级 C57BL-6J 雄性小鼠，共                     线悬挂测试用于检测小鼠后肢耐力以及肢体协调
          60只，6～7周龄，体重18～20 g，均购自广东省医学实验                     能力。造模前1 d、造模第5天以及末次给药后进行线悬
          动物中心，动物生产许可证号为 SCXK（粤）2018-0002。                   挂测试。取一根长约 40 cm、直径为 2 mm 的金属细棒，
          所有实验动物均饲养于标准实验动物房中，饲养期间小                           固定在平行于地面 15 cm 的位置，地面处铺一层垫料作
          鼠自由进食及饮水，保持明暗 12 h 交替。适应性喂养 7                      为缓冲，保护小鼠不被摔伤。每次将1只小鼠从饲养笼
          d后开展实验。本实验通过了广东省医学实验动物中心                           转移至中转笼，待小鼠状态稳定后，将小鼠双前肢挂于
          实验动物伦理委员会审查，编号为C202301-2。                          细绳中央，观察1 min内小鼠双后肢抓细棒的能力；若小
          2 方法                                               鼠双后肢均能抓住细棒记为3分，只有一后肢能抓住细
                                                                                               [16]
          2.1 药物制备                                           棒记为 2 分，无后肢抓住细棒记为 1 分 。重复实验 3
             （1）造模药：称取适量MPTP粉末，加入适量0.9%氯                     次，每次实验间隔5 min。
          化钠溶液溶解，以每管 5 mL 分装于棕色离心管中，                         2.4 动物取材
          －20 ℃保存。（2）胆南星混悬液：将生天南星粉碎后过8                           末次灌胃给药后，小鼠禁食不禁水，12 h后称体重，
          号筛，从新鲜牛胆顶端破口倒出胆汁，将生天南星细粉                           腹腔注射2%戊巴比妥钠（45 mg/kg）麻醉，每组取9只小
          和牛胆汁按质量比1∶4进行混匀，复装于牛胆内，封口后                         鼠于眼眶取血，将血液在室温静置 1 h 后，在 4 ℃下以
          悬挂于低温通风处。3个月后取下，破开牛胆皮，将胆南                          3 000 r/min 离心 15 min，收集血清，－80 ℃保存，备用。
          星取出后粉碎，过 8 号筛，干燥后制得胆南星细粉 ，加                        将取血后的小鼠颈椎脱臼处死，在冰上分离脑组织的黑
                                                    [13]
          0.5% 羧甲基纤维素钠溶液混匀后备用。（3）阳性对照药                       质，－80 ℃保存，备用。另外每组取3只小鼠，麻醉后经
          左旋多巴片混悬液：将左旋多巴片研磨成细粉，加 0.5%                        生理盐水或磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后，使用 4% 多聚
          羧甲基纤维素钠溶液混匀，备用。                                    甲醛灌注固定；取出小鼠脑组织，置于4%多聚甲醛中固
          2.2 动物分组、造模与给药                                     定 3 d 后，用 15%、20%、30% 蔗糖梯度脱水，待脑组织下
              小鼠适应性喂养7 d后，进行为期3 d的行为学训练                      沉后进行冰冻切片（厚度约10 μm）。
         （包括爬杆测试、线悬挂测试），根据行为学表现将个体                           2.5 小鼠脑黑质致密部TH阳性神经元数量检测
          差异明显的小鼠剔除。结果未发现行为异常者。将 60                              每组选取 3 个样本，采用免疫荧光法检测小鼠脑黑
          只小鼠按体重随机分成5组，每组12只，分别为正常组、                         质 TH 阳性神经元数量。用蒸馏水洗切片 3 次，然后以
          模型组、左旋多巴片组[80 mg/（kg·d），为成人临床等效                    0.3%H2O2浸泡10 min，再以0.01 mol/L的PBS洗3次、每
          剂量]和胆南星低、高剂量组[0.39、1.56 g/（kg·d），分别为               次 5 min；3%BCA 封闭 30 min 后，滴加兔源 TH 抗体（稀
          成人临床低剂量（3 g）的 1、4 倍剂量]。除正常组外，其                     释比例1∶2 000），37 ℃孵育1 h；以0.01mol/L的PBS洗3
                                                                                         ®
          余各组小鼠均腹腔注射 MPTP 溶液[35 mg/（kg·d）]，每                 次、每次 5 min，滴加 Alexa Fluor  488 标记的山羊抗兔
                                            [14]
          天 1 次，连续 5 d，以建立亚急性 PD 模型 ；正常组小鼠                   IgG H&L 二抗（稀释比例 1∶200），37 ℃孵育 30 min；以
          同步腹腔注射生理盐水[10 g/（kg·d）]。从实验第6天开                    0.01 mol/L 的 PBS 洗 3 次、每次 5 min，滴加含 DAPI 的水
          始，正常组和模型组小鼠每天灌胃0.5%羧甲基纤维素钠                         基封固剂避光孵育5 min。使用激光共聚焦显微镜扫描


          中国药房  2023年第34卷第15期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 15    · 1811 ·
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