Page 51 - 《中国药房》2023年14期
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和 THD+3-MA 组（预先 12 h 加入 1 g/mL 的 THD 含药血           3 结果
          清+100 mmol/L 的 3-MA），每组设 3 个复孔。对照组、                3.1 细胞实验结果
          PTX组、雷帕霉素组、3-MA组、THD组加入“2.3”项下的                    3.1.1 细胞增殖率比较
          空白血清，THD+PTX组和THD+3-MA组加入“2.3”项下                       与对照组相比，THD 组细胞增殖率无明显变化，
          的 THD 含药血清（1 g/mL），孵育 12 h 后，各药物组分别                PTX 组和 THD+PTX 组细胞增殖率均显著降低（P＜
          加入相应药物继续孵育12 h。收集细胞，裂解，离心，取                        0.05）。与PTX组相比，THD+PTX组细胞增殖率显著升
          上清液用 BCA 定量试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性，                         高（P＜0.05）。结果见图1。
          电泳分离，转膜，封闭后，加入一抗 LAMP2、Beclin1、                             150
          PI3K、Akt、mTOR（稀释比分别为1∶100、1∶500、1∶1 000、
          1∶1 000、1∶1 000），在 4 ℃下孵育过夜；次日加入二抗                          100                        ab
         （稀释比为 1∶2 000），孵育2 h。以凝胶成像系统进行成                              细胞增殖率/%             a
          像，使用 Quantity One 4.6 软件分析蛋白条带灰度值，以                          50
          GAPDH作为内参，计算目标蛋白与内参的灰度值比值，
          并与对照组进行比较计算 LAMP2、Beclin1、PI3K、Akt、                           0
                                                                           对照组    THD组   PTX组  THD+PTX组
          mTOR蛋白的相对表达量。                                         a：与对照组相比，P＜0.05；b：与PTX组相比，P＜0.05。
          2.5 动物实验                                                    图1 各组细胞增殖率比较（n＝3）
          2.5.1 分组、给药与药效学考察
                                                             3.1.2 细胞中自噬相关蛋白表达比较
              大鼠随机分为对照组、模型组和THD高、低剂量组，
                                                                 与 对 照 组 相 比 ，雷 帕 霉 素 组 和 THD 组 细 胞 中
          每组 6 只。除对照组大鼠腹腔注射等体积 0.9% 氯化钠                      LAMP2、Beclin1 蛋白的相对表达量均显著升高（P＜
          注射液外，其余 3 组大鼠分别在第 1、3、5、7 天腹腔缓慢                    0.05），3-MA组和PTX组细胞中LAMP2、Beclin1蛋白的
          注入 PTX（8 mg/kg）以诱导外周神经损伤模型。THD                     相对表达量均显著降低（P＜0.05）。与 PTX 组相比，
          低、高剂量组在造模同时每天分别灌胃 1、2 g/mL 的                       THD+PTX组细胞中LAMP2、Beclin1蛋白的相对表达量
          THD，对照组和模型组大鼠在造模同时每天分别灌胃等                          均显著升高（P＜0.05）。与3-MA组相比，THD+3-MA组
          体积 0.9% 氯化钠注射液，每天 2 次，连续 3 周。给药剂                   细胞中 LAMP2、Beclin1 蛋白的相对表达量均显著升高
          量按前期药效学基础实验结果确定               [13―14] ，机械刺激撤足     （P＜0.05）。结果见图2。
          阈值低于4 g为造模成功。药效学考察内容见文献[14]，
          结果显示外周神经损伤造模成功，THD 对 PTX 导致的                          Beclin1                                51 kDa
          外周神经损伤具有改善作用。                                         LAMP2                                  18 kDa
          2.5.2 大鼠坐骨神经中标志蛋白、自噬相关蛋白和
                                                                GAPDH                                  37 kDa
          PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达的检测
                                                                                     Ⅳ
              末次给药后，处死“2.5.1”项下各组大鼠，取坐骨神                              Ⅰ    Ⅱ    Ⅲ   A.电泳图  Ⅴ   Ⅵ   Ⅶ
          经组织适量，剪碎，裂解，离心，提取坐骨神经总蛋白，用                              250
          BCA 定量试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性，电泳分离，                              200      a  a  a               Beclin1
          转膜，封闭后，分别加入一抗MBP、MPZ、LAMP2、S100、                        150           a               LAMP2
          Beclin1、PI3K、Akt、mTOR（稀释比分别为1∶100、1∶100、                蛋白相对表达量/%
          1∶100、1∶100、1∶500、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000），4 ℃孵         100               b  b
          育过夜；次日加入二抗（稀释比为 1∶5 000），室温孵育 2                          50                    c  c  a  a  a  a
          h；加入 ECL 发光液，以凝胶成像系统进行成像，每个实                             0
          验重复 3 次。以 GAPDH 作为内参，计算目标蛋白与内                                Ⅰ   Ⅱ    Ⅲ    Ⅳ    Ⅴ   Ⅵ    Ⅶ
                                                                                 B.柱状图（n＝3）
          参的灰度值比值，并与对照组进行比较计算MBP、MPZ、
                                                                Ⅰ：对照组；Ⅱ：雷帕霉素组；Ⅲ：THD组；Ⅳ：THD+PTX组；Ⅴ：
          LAMP2、S100、Beclin1、PI3K、Akt、mTOR 蛋白的相对表            THD+3-MA组；Ⅵ：PTX组；Ⅶ：3-MA组；a：与对照组相比，P＜0.05；b：
          达量。                                                与PTX组相比，P＜0.05；c：与3-MA组相比，P＜0.05。
          2.6 统计学方法                                                图2 各组细胞中自噬相关蛋白表达比较
              采用SPSS 22.0软件进行统计分析。数据以x±s表                    3.1.3 细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达比较
          示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较                               与对照组相比，雷帕霉素组、THD 组和 PTX 组细胞
          采用Bonferroni法。检验水准α＝0.05。                          中PI3K、Akt、mTOR蛋白的相对表达量均显著降低（P＜


          中国药房  2023年第34卷第14期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 14    · 1709 ·
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