Page 50 - 《中国药房》2023年14期
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中医认为PTX导致的外周神经损伤属于痹症，主要 碧云天生物技术有限公司；其余试剂均为分析纯或实验
由血瘀、气虚和阴虚造成，临床治疗常以温经活血、益气 室常用规格。
补气、化瘀为主。桃红四物汤（Taohong siwu decoction， 1.3 动物与细胞
THD）是 2018 年国家中医药管理局发布的《古代经典名 SPF级SD大鼠，雌性，体重为160～180 g，购自斯贝
[8]
方目录（第一批）》中的经典方剂 ，具有活血益气、化瘀 福（北京）生物技术有限公司，动物生产许可证号为
生新的功效，对缺氧损伤、肝肾损伤、冠心病等均有良好 SCXK（京）2019-0010。本实验所有操作均符合实验动
的改善作用 [9―10] ，且临床已有THD用于治疗外周神经损 物伦理学要求，并通过天津中医药大学实验动物伦理委
伤的报道 [11―12] 。笔者前期研究也证实，THD对PTX导致 员会批准，伦理号为 TCM-LAEC2021096。大鼠 SC 系
的外周神经损伤具有改善作用 ，但其具体的分子机制 RSC96细胞购自美国ATCC公司。
[13]
尚不明确，在此基础上，本文通过体外实验和体内实验 2 方法
考察THD对SC自噬的影响，旨在为揭示THD治疗外周 2.1 细胞培养
神经损伤的作用机制提供参考。 RSC96 细胞于 37 ℃、5%CO2培养箱中用 DMEM 培
1 材料 养基培养，传代3次后用于实验。
1.1 主要仪器 2.2 THD水煎剂的制备
本研究所用主要仪器有TD5型高速离心机（湖南赫 按《古代经典名方目录（第一批）》中 THD 配比 12∶
西仪器装备有限公司）、Synergy H1型全功能酶标仪（美 16∶6∶4∶4∶4（m/m）称取地黄、当归、白芍、川芎、桃仁、红
国 BioTek 公司）、CKX41 型荧光相差倒置显微镜（日本 花各适量，按每 1 g 生药加水 5 mL 浸泡 30 min，煮沸后
Olympus公司）、JS-Power300型电泳仪（上海培清科技有 慢煎 20 min，过滤；二煎按每 1 g 生药加水 3 mL，煮沸后
限公司）、ChemiDocMP Imaging System型凝胶成像分析 慢煎20 min，过滤；合并2次滤液，浓缩，得THD水煎剂。
系统（美国Bio-Rad公司）。 2.3 空白血清和THD含药血清的制备
1.2 主要药品与试剂 将10只大鼠随机分为空白血清组和THD组，每组5
地黄、当归、白芍、川芎、桃仁、红花饮片（批号分别 只。THD组大鼠每天灌胃1 g/mL（按生药量计，下同）的
为 031201、201516、201035、190927、060707、213010）均 THD 水煎剂，空白血清组大鼠灌胃等体积 0.9% 氯化钠
购自天津医药津一堂药房，送检天津医药集团有限公司 注射液，给药体积按10 mL/kg计，每天给药2次，连续14
鉴定，均为真品；PTX 注射液（规格 30 mg∶5 mL，批号 d。末次给药 30 min 后腹主动脉取血，3 000 r/min 离心
2107021）购自重庆莱美药业有限公司；3-甲基腺嘌呤[3- 15 min，取血清。
methyladenine（3-MA），纯度≥98%，批号191121]和雷帕 2.4 细胞实验
霉素（纯度≥99%，批号3682X）购自美国Med Chem Ex‐ 2.4.1 细胞增殖率的检测
press 公司；0.9% 氯化钠注射液（批号 2E84B1）购自中国 采用 MTT 法进行检测。取 RSC96 细胞按 5×10 3
大冢制药有限公司；BCA 定量试剂盒（批号 4093890）购 个/孔接种于 96 孔板中，分为对照组、THD 组、PTX 组和
自美国Thermo Fisher Scientific公司；山羊抗兔自噬标记 THD+PTX 组，每组设 3 个复孔。按预实验结果设计给
蛋白酵母 Atg6 同源物（Beclin1）多克隆抗体、辣根过氧 药剂量，对照组、THD 组和 PTX 组加入“2.3”项下的空
化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗、山羊抗兔甘油醛-3-磷 白血清，THD+PTX 组加入“2.3”项下的 THD 含药血清
酸 脱 氢 酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， （1 g/mL），孵育 12 h 后，THD 组加入 THD 含药血清（1
GAPDH）单克隆抗体、山羊抗兔磷脂酰肌醇 3-激酶 g/mL），PTX组和THD+PTX组加入终浓度为0.1 μmol/L
（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）多克隆抗体、山羊抗兔 的 PTX，继续孵育 12 h，然后加入 MTT 溶液培养 4 h，再
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamy‐ 加入二甲基亚砜终止培养。用酶标仪于 492 nm波长处
cin，mTOR）多克隆抗体、山羊抗兔蛋白激酶 B（又称 检测各组细胞的光密度（OD）值，计算细胞增殖率，细胞
Akt）多克隆抗体、小鼠源细胞自噬溶酶体关联膜蛋白 2 增殖率＝试验组OD值/对照组OD值×100%。
（lysosomal-associated membrane protein-2，LAMP2）多克 2.4.2 细胞中自噬相关蛋白和 PI3K/Akt/mTOR 信号通
隆抗体、小鼠髓鞘碱性蛋白质（myelin basic protein， 路蛋白表达的检测
MBP）多克隆抗体、大鼠源鞘磷脂蛋白（myelin protein 采用 Western blot 法进行检测。按预实验结果设计
3
zero，MPZ）多克隆抗体、大鼠 S100 钙结合蛋白（简称 给药剂量，取 RSC96 细胞按 5×10 个/孔接种于 6 孔板
“S100”）多克隆抗体（批号分别为 030716E、1100213、 中，分为对照组、PTX 组（0.1 μmol/L）、自噬促进剂雷帕
2009876A、20319700231、212203C、YM9036、8379065- 霉素组（50 ng/mL）、自噬抑制剂3-MA组（100 mmol/L）、
21、10985A、99467A、1255782）以及DMEM基础培养基、 THD 组（1 g/mL 的 THD 含药血清）、THD+PTX 组（预先
胎牛血清（批号分别为 20001563、21A056）均购自上海 12 h 加入 1 g/mL 的 THD 含药血清+0.1 μmol/L 的 PTX）
· 1708 · China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 14 中国药房 2023年第34卷第14期
