Page 56 - 《中国药房》2023年14期
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有限公司；其余试剂均为国产分析纯，水为蒸馏水。                             非平台象限面壁放入水中，使其寻找平台，记录小鼠的
          1.3 实验动物                                            游泳潜伏期（即从入水至找到平台的时间），若小鼠在
              本研究实验动物包括 SPF 级 C57BL6 小鼠 10 只和                 60 s内未能成功登上平台，则将游泳潜伏期记为60 s；同
          特异性较高且可模拟 AD 发病过程中 tau 蛋白过度磷酸                       时，应用木棍引导60 s内未成功找到平台的小鼠登上平
          化的 SPF 级 P301S 小鼠 36 只，4 月龄，体重为 20～24 g，            台，每次训练间隔 4 h。检测期为 1 d，取出桶内平台装
          雌雄各半，由江苏集萃药康生物科技有限公司提供，动                            置，将小鼠从目标象限的对侧面壁放入水中，让其自由
          物生产许可证号为 SCXK（苏）2019-0009。所有小鼠均                     游泳60 s，记录60 s内小鼠穿越平台次数和游泳速度。
          饲养于环境温度 20～23 ℃、相对湿度 50%～60% 的实                     2.4 小鼠脑组织形态学观察
          验动物中心内，自由摄食、饮水。本研究方案均严格遵                                采用苏木精-伊红（HE）染色法进行观察。Morris水
          循我国动物实验管理相关法规的要求，并经实验所在单                            迷宫实验结束后，随机选取每组5只小鼠，以3%戊巴比
          位动物伦理委员会审核批准（编号SYYXY2021042501）。                    妥钠腹腔注射进行麻醉，快速取出其脑组织并置于 4%
          2 方法                                                多聚甲醛中固定 24 h；脑组织经常规石蜡包埋后切片

          2.1 分组与给药                                          （厚度约4 μm），脱蜡、脱水，用HE染色并置于光学显微
              取 P301S 小鼠 36 只，按体重分为模型组、癫痫清颗                   镜下观察海马结构的完整性及神经细胞膜的连续性。
          粒组和盐酸多奈哌齐组，每组 12 只；另取 C57BL6 小鼠                     2.5 小鼠脑组织神经细胞结构及尼氏体数量检测
          10 只，作为对照组。本课题组在前期研究中，多次考察                              采用尼氏染色法进行检测。取“2.4”项下各组小鼠
          了癫痫清颗粒不同剂量（12.48、6.24、3.12 g/kg）的抗AD                脑组织的石蜡切片，常规脱蜡至水；用水冲洗 5 min，加
                                        [10]
          作用，发现 12.48 g/kg 的效果最优 ，故本研究以 12.48                 入 1% 甲苯胺蓝染料，室温孵育 6 min；用水冲洗 3 min，
          g/kg 作为癫痫清颗粒的剂量；同时，参考本课题组前期                         再依次于70%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯中静置
                  [10]
          研究成果 ，以1.3 mg/kg作为盐酸多奈哌齐的剂量。各                       5、5、1、5 min；封片，使用光学显微镜观察神经细胞结构
          药物组小鼠灌胃相应药液（以水为溶剂），对照组和模型                          （神经细胞的细胞核为深蓝色的圆形或椭圆形），采用
          组小鼠灌胃等体积水。灌胃体积均为 20 mL/kg，每天 1                      Leica quantity 570 图像分析系统进行尼氏体（即神经细
          次，连续5个月。                                            胞的细胞质内散在的多角形小块）计数。
          2.2 小鼠一般状况观察                                        2.6 小鼠脑组织中AT8蛋白表达水平测定
              实验期间，于每天上午 8 点观察各组小鼠的一般状                            采用免疫组织化学法进行测定。取“2.4”项下各组
          况，包括体重、活动度、毛发光泽度及死亡情况等。                             小鼠脑组织的石蜡切片，常规脱蜡至水；置于 3% 过氧
          2.3 小鼠学习记忆能力检测                                      化氢溶液中修复 10 min，冷却至室温；以 5% 牛血清白
              末次灌胃后，采用自制实验装置（由3个木质支臂组                         蛋白封闭，37 ℃下孵育 40 min；加入 AT8 一抗（稀释比
          成）进行Y迷宫实验：将各组小鼠放在支臂的交叉点处，                           例为 1∶200），4 ℃下孵育过夜；滴加相应二抗（稀释比例
          记录8 min内小鼠进入支臂的总次数；同时，以连续进入                         为 1∶3 000），37 ℃下孵育 30 min；以二氨基联苯胺显色
          3 个不同支臂作为 1 次正确交替反应，计算小鼠的自发                         后，再以苏木精复染；脱水，透明，封片，使用光学显微镜
          交替反应率：自发交替反应率＝正确交替反应次数/（进                           观察（细胞内可见棕黄色颗粒即为AT8蛋白表达阳性），
          入支臂总次数－2）×100%。                                     采用 JEOA 801D 形态学图像分析系统计算各组小鼠脑
              随后，采用自制白色圆桶状装置（直径 80 cm、高 33                    组织中AT8蛋白阳性表达细胞的平均光密度值，并以此
          cm，上有摄像头）进行 Morris 水迷宫实验：操作时，以圆                     表示该蛋白的表达水平。
          桶中心为原点，将其划分为4个等面积的扇形区域，分别                           2.7 小鼠脑组织中自噬、突触相关蛋白表达和tau蛋白
          记为第1至第4象限；将一圆形平台置于第1象限扇形区                           磷酸化检测
          域内的中间位置。桶内装水，水温控制在（23±1） ℃并                             采用 Western blot 法进行检测。Morris 水迷宫实验
          保持水面高于平台1 cm。实验分为适应期、训练期和检                          结束后，选取每组另4只小鼠，以3%戊巴比妥钠腹腔注
          测期。适应期为１ｄ，将各组小鼠腹部朝下，从任意位                            射进行麻醉，快速取出脑组织，冰上分离海马组织，加入
          置放入水中，使其自由游泳，找到平台后使小鼠在平台                            蛋白裂解液提取蛋白，以 BCA 法测定蛋白浓度并作变
          上停留10 s以适应平台安全区，若小鼠在60 s内仍未寻                        性处理。取变性蛋白适量进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯
          找到平台，则用木棍将其引导至平台，并使其在平台上                            酰胺凝胶电泳，转膜；用 5% 脱脂奶粉室温封闭 2 h，加
          停留 10 s。训练期为 5 d，每天进行 2 次训练，将小鼠从                    入线粒体自噬相关蛋白一抗[PINK1、Parkin、LC3B、p62


          · 1714 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 14                            中国药房  2023年第34卷第14期
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