Page 30 - 《中国药房》2023年14期

2.4 PPⅥⅥ对细胞凋亡率影响的检测 120 24 h
取对数生长期的细胞，按5×10 个/孔接种于6孔板 100 48 h
5
a a 72 h
中，培养 24 h。将细胞分为对照组和不同浓度 PPⅥ组 80 a a a a
（分别含 PPⅥ 4、8 μmol/L，浓度参考“2.2”项下结果设 存活率/% 60 a a a
置），每组设3个复孔。培养24 h后，消化并收集细胞，用 40 a a a a
a
磷酸盐缓冲液清洗5 min×2次，并用培养基调整细胞密 20 a
a a
a a a
6
度至 1×10 个/mL。取上述细胞悬液 100 μL 置于 5 mL 0 a
组织培养管中，加入 Annexin-Ⅴ/FITC 试剂 10 μL，室温 对照组 1 2 4 8 16 32 64
PPⅥ组/（μmol/L）
避光孵育15 min；加入PI染液5 μL，混匀，室温避光孵育 a：与同时间点对照组比较，P＜0.01。
10 min，使用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。 图1 PPⅥⅥ对细胞增殖能力的影响（x±s，n＝5）
2.5 PPⅥⅥ对细胞中凋亡相关蛋白、通路相关蛋白表达
影响的检测
细胞培养及药物处理同“2.4”项。培养24 h后，提取
各组细胞的总蛋白并定量，经变性后进行电泳分离、转
膜、封闭。分别加入凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、cleaved
caspase-3）、Fas/FasL 通路相关蛋白（Fas、FasL、cleaved
caspase-8）、Akt/GSK-3β 通 路 相 关 蛋 白（Akt、p-Akt、 A.对照组 B. PPⅥ 2 μmol/L 组
GSK-3β、p-GSK-3β）和内参蛋白（β-actin）一抗（稀释比
例均为 1∶1 000），4 ℃孵育过夜；加入相应二抗（稀释比
例为 1∶1 000），室温孵育 1 h；避光加入 ECL 化学发光
液，孵育 1～2 min 曝光显影，并置于化学发光凝胶成像
系统下成像。使用 Image J 软件分析各条带的灰度值，
以 Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、Fas、FasL、cleaved cas‐
pase-8蛋白与内参蛋白条带的灰度值比值表示上述蛋白 C. PPⅥ 4 μmol/L 组 D. PPⅥ 8 μmol/L 组
图2 PPⅥ对细胞克隆形成能力的影响
的表达水平，以 p-Akt 与 Akt、p-GSK-3β 与 GSK-3β 蛋白
表1 PPⅥⅥ对细胞克隆数和克隆形成率的影响（x±s，
条带的灰度值比值表示 Akt、GSK-3β 蛋白的磷酸化
n＝3）
水平。
组别 克隆数 克隆形成率/%
2.6 统计学方法 对照组 259.67±45.45 51.93±9.09
采用 GraphPad Prism 5.0 软件对数据进行统计分 PPⅥ 2 μmol/L组 168.33±32.50 a 33.67±6.50 a
PPⅥ 4 μmol/L组 68.67±35.92 b 13.73±7.18 b
析。数据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分
PPⅥ 8 μmol/L组 22.67±16.62 b 4.53±3.32 b
析，进一步两两比较用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。 a：与对照组比较，P＜0.05；b：与对照组比较，P＜0.01。
3 结果 3.3 PPⅥⅥ对细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响
3.1 PPⅥⅥ对细胞增殖能力的影响 流式细胞仪检测结果显示，随着 PPⅥ浓度的增加，
与对照组比较，不同浓度 PPⅥ（1、2、4、8、16、32、64 细胞凋亡有增多的趋势，各药物组的细胞凋亡率均较对
μmol/L）分别干预不同时间（24、48、72 h）后，细胞的存 照组显著升高（P＜0.05 或 P＜0.01）。凋亡相关蛋白表
达检测结果显示，与对照组比较，各药物组细胞中 Bax、
活率均显著降低（P＜0.01），且有一定的浓度-时间依赖
cleaved caspase-3 蛋白的表达水平均显著升高，Bcl-2 蛋
趋势；IC50 分别为（8.05±1.03）μmol/L（24 h）、（5.47±
白的表达水平均显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01）。结果
0.28）μmol/L（48 h）、（4.09±1.24）μmol/L（72 h）。结果
见图3、表2。
见图1。
3.4 PPⅥⅥ对细胞Fas/FasL、Akt/GSK-3ββ通路相关蛋白
3.2 PPⅥⅥ对细胞克隆形成能力的影响
表达的影响
经不同浓度（2、4、8 μmol/L）的PPⅥ干预后，各组细 与对照组比较，各药物组细胞中 Fas、FasL、cleaved
胞的克隆数和克隆形成率均较对照组显著降低（P＜ caspase-8 蛋白的表达水平均显著升高，Akt、GSK-3β 蛋
0.05 或 P＜0.01），且这种作用有一定的浓度依赖趋势。 白的磷酸化水平均显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01）。结
结果见图2、表1。 果见图4、表3。

· 1688 · China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 14 中国药房 2023年第34卷第14期